GB 5009.213-2016 食品安全国家标准 贝类中麻痹性贝类毒素的测定

中华人民共和国国家标准

—

GB5009.2132016

食品安全国家标准

贝类中麻痹性贝类毒素的测定

2016-12-23发布2017-06-23实施

中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会

发布

国家食品药品监督管理总局

—

GB5009.2132016

前言

本标准代替/—《贝类中麻痹性贝类毒素的测定》、/—《贝类中

GBT5009.2132008GBT232152008

多种麻痹性贝类毒素含量的测定液相色谱荧光检测法》、/—《麻痹性贝类毒素的测定

-SCT30232004

生物法》、—《出口贝类麻痹性贝类毒素检验方法》、/—《进出口贝类产品

SN03521995SNT17352006

》/—《

中麻痹性贝类毒素检验方法高效液相色谱法和进出口贝类中麻痹性贝类毒素

SNT17732006

检验方法酶联免疫吸附试验法》。

/—,:

本标准与GBT5009.2132008相比主要变化如下

———“”;

标准名称修改为食品安全国家标准贝类中麻痹性贝类毒素的测定

———增加了酶联免疫吸附法;

———增加了液相色谱串联质谱法。

-

Ⅰ

—

GB5009.2132016

食品安全国家标准

贝类中麻痹性贝类毒素的测定

1范围

,,

本标准规定了贝类中麻痹性贝类毒素测定的小鼠生物法酶联免疫吸附方法液相色谱法和液相色

谱串联质谱法。

-

、。

本标准适用于牡蛎扇贝等贝类及其制品中麻痹性贝类毒素的检测

小鼠生物法

2原理

()。,

用盐酸提取贝类中麻痹性贝类毒素PSP记录小鼠腹腔注射提取液后的死亡时间根据麻痹性

(),

贝类毒素致小鼠死亡时间与鼠单位关系的对照表查出鼠单位MU并按小鼠体重对鼠单位进行校正

(),。,

得到校正鼠单位CMU计算得到每100g样品中PSP的鼠单位以石房蛤毒素作为标准将鼠单位

,。

换算成毒素的微克数计算每100g贝肉中的PSP微克数测定结果代表存在于贝肉内各种化学结构

的PSP毒素总量。

3试剂和材料

,,/。

除非另有说明本方法所用试剂均为分析纯水为GBT6682规定的一级水

3.1试剂

氢氧化钠()。

3.1.1NaOH

盐酸()。

3.1.2HCl

无水乙醇()。

3.1.3CHCHOH

32

3.2试剂配制

(/):。

3.2.1氢氧化钠溶液0.1molL将4.0g氢氧化钠溶于1L水中

(/):。

3.2.2盐酸溶液0.18molL将15.5mL盐酸用蒸馏水稀释至1L

(/):。

3.2.3盐酸溶液5molL将45mL盐酸用水稀释至100mL

:,,,(/)

3.2.4酸性乙醇溶液量取无水乙醇200mL用水稀释至1000mL混匀用盐酸溶液5molL调节

至。

pH2.0~4.0

3.3标准品

(,·,):。

石房蛤毒素标准品号纯度

STXCHNO2HClCAS35554-08-6≥98.0%

101774

3.4标准溶液的配制

(/):,,

3.4.1石房蛤毒素标准储备液100mL准确称取适量STX标准品用酸性乙醇溶液溶解并定容

μg

1

—

GB5009.2132016

配制成的质量浓度为/的标准储备液。

STX100mL

μg

(/):(/),

3.4.2石房蛤毒素标准工作液1mL准确吸取1mL石房蛤毒素标准储备液100mL用水

μgμg

,(/),。

稀释用盐酸溶液调节至用水定容至该标准工作液于下

5molLpH2.0~4.0100mL0℃~4℃

可保存30d。

3.5材料

:。

3.5.1小鼠体重为19~21的健康ICR系雄性小鼠

gg

3.5.2H计或H试纸。

pp

4仪器和设备

4.1均质器。

:。

4.2分析天平感量为0.1g和0.0001g

:/。

4.3离心机转速≥2000rmin

5分析步骤

:,。、

注为避免毒素的危害应戴手套进行操作移液管及移液器吸头等用过的器材废弃的提取液等应在次氯酸钠溶

()。、,

液5%中浸泡1h以上以使毒素分解对于动物实验过程中产生的污水废弃物及动物尸体处理应参照

GB14925执行。

5.1样品采集

,。,

从2kg以上样品中采取足够贝类个数去壳使贝肉达200g以上不能及时送检的新鲜贝类开

,(/),,。

壳将贝肉分离将沥水后的200g贝肉放入200mL盐酸溶液0.18molL中置4℃保存备检

5.2试样制备

、

5.2.1牡蛎蛤及贻贝

,,,。

用清水将贝类样品外表彻底洗净切断闭壳肌开壳用蒸馏水淋洗内部去除泥沙及其他异物将

,,。。

闭壳肌和连接在胶合部的组织分开仔细取出贝肉切勿割破贝体严禁加热或用麻醉剂开壳收集约

(),,。

200g贝肉分散置于筛子中沥水5min不要使肉堆积捡出碎壳等杂物将贝肉均质备用

5.2.2扇贝

,。

取可食部分用作检测按5.2.1均质后备用

5.2.3冷冻贝类

,(),、、、、。

在室温下使冷冻的样品带壳或脱壳的自然融化按5.2.1开壳淋洗取肉均质备用

5.2.4贝类罐头

()。,

将罐内所有内容物肉及液体充分均质如果是大罐将贝肉沥水并收集沥下的液体分别称重并

,,。

存放固形物和汤汁将固形物和汤汁按原罐装比例混合均质后备用

5.2.5用酸保存的贝肉

,,。

沥去酸液分别存放贝肉及酸液备用

2

—

GB5009.2132016

5.2.6贝肉干制品

(/)(),,

干制品可于等体积盐酸溶液0.18molL中浸泡24h~48h4℃冷藏沥去酸液分别存放贝肉

及酸液备用。

5.3PSP标准品对照试验

5.3.1PSP标准工作液的配制

、、、,

用和水分别稀释石房蛤毒素标准工作液配制成系列

10mL15mL20mL25mL30mL10mL

浓度的标准稀释液。

5.3.2中位数死亡时间的PSP标准工作液选择

,,

取按5.3.1配制的系列浓度的标准稀释液各1mL腹腔注射小鼠数只选择中位数死亡时间为

。,。

5min~7min的浓度剂量如某浓度稀释液已达到要求还需以1mL水的增减量进行补充稀释试验

,,

每只小鼠试验前称重以只小鼠为一组用中位数死亡时间在范围内的两个浓度

105min~7min

,。

的标准稀释液注射小鼠测定并记录每只小鼠腹腔注射完毕至停止呼吸的所需死亡时间

毒素转换系数()的计算

5.3.3CF

5.3.3.1小鼠中位数死亡时间的选择

。

计算5.3.2中所选择浓度的标准稀释液受试组的中位数死亡时间弃去中位数死亡时间小于

;,

5min或大于7min的受试组选择中位数死亡时间在5min~7min的受试组该受试组中可允许有个

别小鼠的死亡时间可小于5min或大于7min。

校正鼠单位()的计算

5.3.3.2CMU

,

对于所选定的中位数死亡时间为的受试组根据附录查得该组中每只小鼠死亡时

5min~7minA

(),,

间所对应的鼠单位再根据附录查得组中每只小鼠体重所对应的体重校正系数同一只小鼠的

MUB

体重校正系数与鼠单位相乘得到该只受试小鼠的校正鼠单位()。

CMU

毒素转换系数()的计算

5.3.3.3CF

()():

单只小鼠的毒素转换系数按式计算

CF1

c

…………()

CF=1

CMU

式中:

———,(/);

CF毒素转换系数单位为微克每毫升μgmL

———,(/);

c每毫升STX标准稀释液中的毒素含量单位为微克每毫升μgmL

CMU———校正鼠单位。

(),,

得到单只小鼠的毒素转换系数后再计算每组只小鼠的平均值即为组内毒素转换系

CF10CF

数()。

CF

1

组间毒素转换系数()的计算

5.3.3.4CF

2

,()。

取不同受试组的组内毒素转换系数的平均值即为组间毒素转换系数CF以组间毒素转换系

2

数进行试样毒力的计算。

3

—

GB5009.2132016

5.3.3.5CF值定期检查

,,。

如检测间隔时间较长每次测定时要用适当的标准稀释液注射只小鼠重新测定值如

PSP5CF

,,

果一周有几次检测则用中位数死亡时间的标准稀释液每周检查一次测得的值应在

5min~7minCF

。,,

原测定值的范围内若结果不符则用同样的标准稀释液另外注射只小鼠综合之前注射

CF±20%5

,。,

的只小鼠的结果计算出值并用同样的标准稀释液注射第二组只小鼠将第二组求出的

5CF10CF

,。

值和第一组的值进行平均即为一个新的值

CFCF

,,

重复检查的值通常在原结果的之内若经常发现有较大偏差在进行常规检测前应调查

CF±20%

该方法中是否存在可变影响因素。

5.4试样提取

,(/),,,

取试样于烧杯中加盐酸溶液充分搅拌均质调节至必

100g0.18molL100mLpH2.0~4.0

,(/)(/),,

要时可逐滴加入盐酸溶液5molL或氢氧化钠溶液0.1molL调节pH加碱时速度要慢同时需不

,。,,,

断搅拌防止局部碱化破坏毒素将混合物加热煮沸5min冷却至室温移至量筒中并稀释至200mL

调节至。

pH2.0~4.0

,,,,

将混合物倒回烧杯搅拌均匀自然沉降至上清液呈半透明状不堵塞注射针头即可必要时将混合

/,。。

物或上清液以3000rmin离心5min或用滤纸过滤收集上清液备用

5.5小鼠试验

,。,

取健康雄性小鼠只称重并记录重量随机分为实验组和空白对照组两组

19.0~21.0ICR6

gg

每组只。

3

,

对每只实验组小鼠腹腔注射1mL试样提取液对每只空白对照组腹腔注射1mL盐酸溶液

(/)。,,。

0.18molL注射过程中若有一滴以上提取液溢出须将该只小鼠丢弃并重新注射一只小鼠记录

,()。

注射完毕时间仔细观察并记录小鼠停止呼吸时的死亡时间到小鼠呼出最后一口气止

,,。

若注射试样提取液后只或只小鼠的死亡时间大于需再注射至少三只小鼠

127min

,,,

若小鼠的死亡时间小于稀释试样提取液后再注射只小鼠直至小鼠在内

5min35min~7min

;,(/)。

死亡稀释试样提取液时需逐滴加入盐酸溶液调节至

0.18molLpH2.0~4.0

6分析结果的表述

6.1以质量分数计的PSP毒力的计算与结果表述

6.1.1以质量分数计的PSP毒力的计算

():

每试样中的含量按式计算

100gPSP2

…………()

XCMUCFDF2002

=1×2××

式中:

———,(/);

X每100g样品中PSP的含量单位为微克每百克μg100g

CMU1———试样受试组小鼠的中位数校正鼠单位;

———,(/);

CF组间毒素转换系数单位为微克每毫升gmL

2μ

DF———稀释倍数;

———,()。

200试样提取液的体积单位为毫升mL

:,;

注根据检测样品受试组的小鼠死亡时间查出附录对应的鼠单位根据附录查出小鼠体重所对应的体重校

AB

,。,。

正系数两者相乘得到该只小鼠的选取受试组中只小鼠的中位数即为

CMU3CMUCMU1

4

—

GB5009.2132016

6.1.2以质量分数计的PSP毒力的结果表述

,:/。

若空白对照组小鼠正常则报告待测样品中PSP毒素含量为×××100

μgg

以计的毒力的计算与结果表述

6.2MUPSP

以计的毒力的计算

6.2.1MUPSP

():

每试样中以计的毒力按式计算

100gMUPSP3

…………()

YCMUDF2003

=1××

式中:

———,(/);

Y每100g样品的MU值单位为鼠单位每百克MU100g

CMU1———实验组小鼠的中位数校正鼠毒力单位;

DF———稀释倍数;

———,()。

200试样提取液的体积单位为毫升mL

:,()。

注对于取得标准品有困难的实验室可按式计算以计的毒力

PSP3MUPSP

以计的毒力的判断与结果表述

6.2.2MUPSP

在空白对照组小鼠正常的情况下进行如下判断和表述:

,,,

若实验组中位数死亡时间小于则应对样品提取液进行稀释再选取只小鼠进行试验直

5min3

,,

至得到中位数死亡时间为5min~7min为止根据最后的稀释液实验结果计算样品的鼠单位毒力报

告该样品的鼠单位毒力为:/。

×××MU100g

,,

若实验组中位数死亡时间大于7min则直接计算确定样品鼠单位毒力报告该样品的鼠单位毒力

为:/。

×××MU100g

,/。

若实验组中所有小鼠在观察15min内均不死亡可报告该样品的鼠单位毒力小于400MU100g

酶联免疫吸附法

7原理

,

游离麻痹性贝类毒素与其酶标记物竞争麻痹性贝类毒素抗体同时麻痹性贝类毒素抗体与捕捉抗

。。

体连接没有被结合的酶标记物在洗涤步骤中被除去结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的

。。

产物加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色用酶标仪在450nm波长下测量微孔溶液的吸光度

,,。

值试样中麻痹性贝类毒素含量与吸光度值成反比按绘制的标准曲线定量计算

8试剂和材料

,,/。

除非另有说明本方法所用试剂均为分析纯水为GBT6682规定的一级水

8.1试剂

盐酸()。

8.1.1HCl

十二水合磷酸氢二钠(·)。

8.1.2NaHPO12HO

242

氯化钠()。

8.1.3NaCl

氯化钾()。

8.1.4KCl

5

—

GB5009.2132016

磷酸二氢钾()。

8.1.5KHPO

24

吐温()。

8.1.6-20CHO

5811426

牛血清白蛋白()。

8.1.7BSA

8.1.8酶标记物。

8.1.9麻痹性贝类毒素抗体。

8.1.10过氧化氢(HO)。

22

,,,四甲基联苯胺(,)。

8.1.113355-TMBCHN

16202

8.1.12硫酸(HSO)。

24

8.2试剂配制

(/):,。

8.2.1盐酸溶液0.1molL量取9mL盐酸用水稀释至1000mL

(/):,。

8.2.2盐酸溶液5molL量取450mL盐酸用水稀释至1000mL

(,):、、

8.2.3磷酸盐缓冲液PBS溶液pH7.4分别称取磷酸二氢钾0.20g十二水合磷酸氢二钠2.90g氯

、,。

化钠8.00g氯化钾0.20g加水溶解并定容至1000mL

:,。

抗体稀释液称取加溶液溶解并定容至

8.2.41.0BSAPBS1000mL

g

:。

8.2.5酶标记物工作液用抗体稀释液将酶标记物稀释至工作浓度

:。

8.2.6麻痹性贝类毒素抗体工作液麻痹性贝类毒素抗体用抗体稀释液稀释至工作浓度

:,。

洗脱液吸取吐温用溶液稀释至

8.2.70.5mL-20PBS1000mL

(/):,,

8.2.8硫酸溶液1molL吸取53.2mL硫酸缓缓加至盛有500mL水的烧杯中并用水定容至

1000mL,混匀。

8.3标准品

石房蛤毒素(,·,号)标准溶液。

STXCHNO2HClCAS35554-08-6

101774

8.4标准溶液配制

:(),

标准系列工作液配制准确吸取适量体积的石房蛤毒素标准溶液用PBS溶液pH7.4稀释配制

/,/,/,/,/,/。

成质量浓度分别为0L2.5L5L10L20L40L的标准系列工作液现用

μgμgμgμgμgμg

现配。

8.5材料

包被有麻痹性贝类毒素捕捉抗体的微孔板。

:,。

注商业化试剂盒若评价技术参数达到本标准的要求则也适合于本标准参见附录C

9仪器和设备

9.1酶标仪。

9.2均质器。

:/。

9.3离心机转速≥6000rmin

10分析步骤

10.1样品采集

同5.1。

6

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GB5009.2132016

10.2试样制备

同5.2。

10.3试样提取

(),(/)[,

称取10g精确至0.1g试样加入70mL盐酸溶液0.1molL如为较干燥的贝肉加入140mL

(/)],,/,

盐酸溶液0.1molL煮沸并搅拌5min4℃条件下6000rmin离心10min上清液用盐酸溶液

(/)。,(),,

调节至以下取提取液加入溶液混匀取进

5molLpH4.0100L900LPBSpH7.450L

μμμ

行测定。

10.4测定