GB 4789.4-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验

中华人民共和国国家标准

GB4789.4—2010

食品安全国家标准

食品微生物学检验沙门氏菌检验

Nationalfoodsafetystandard

Foodmicrobiologicalexamination:Salmonella

2010-03-26发布2010-06-01实施

中华人民共和国卫生部发布

GB4789.4—2010

前言

本标准代替GB/T4789.4-2008《食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验》。

本标准与GB/T4789.4-2008相比，主要变化如下：

——修改了标准的中英文名称；

——修改了标准的范围；

——修改了培养基和试剂；

——修改了设备和材料；

——修改了附录A。

本标准的附录A、附录B为规范性附录。

本标准所代替的历次版本发布情况为：

——GB4789.4-84、GB4789.4-1994、GB/T4789.4-2003、GB/T4789.4-2008。

I

GB4789.4—2010

食品安全国家标准

食品微生物学检验沙门氏菌检验

1范围

本标准规定了食品中沙门氏菌（Salmonella）的检验方法。

本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。

2设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

2.1冰箱：2℃～5℃。

2.2恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃。

2.3均质器。

2.4振荡器。

2.5电子天平：感量0.1g。

2.6无菌锥形瓶:容量500mL，250mL。

2.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

2.8无菌培养皿：直径90mm。

2.9无菌试管：3mm×50mm、10mm×75mm。

2.10无菌毛细管。

2.11pH计或pH比色管或精密pH试纸。

2.12全自动微生物生化鉴定系统。

3培养基和试剂

3.1缓冲蛋白胨水（BPW）：见附录A中A.1。

3.2四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见附录A中A.2。

3.3亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见附录A中A.3。

3.4亚硫酸铋（BS）琼脂：见附录A中A.4。

3.5HE琼脂：见附录A中A.5。

3.6木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：见附录A中A.6。

1

GB4789.4—2010

3.7沙门氏菌属显色培养基。

3.8三糖铁（TSI）琼脂：见附录A中A.7。

3.9蛋白胨水、靛基质试剂：见附录A中A.8。

3.10尿素琼脂（pH7.2）：见附录A中A.9。

3.11氰化钾（KCN）培养基：见附录A中A.10。

3.12赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录A中A.11。

3.13糖发酵管：见附录A中A.12。

3.14邻硝基酚β-D半乳糖苷（ONPG）培养基：见附录A中A.13。

3.15半固体琼脂：见附录A中A.14。

3.16丙二酸钠培养基：见附录A中A.15。

3.17沙门氏菌O和H诊断血清。

3.18生化鉴定试剂盒。

2

GB4789.4—2010

4检验程序

沙门氏菌检验程序见图1。

检样

25g（mL）样品+225mLBPW

36℃±1℃，8h～18h

1mL+TTB10mL1mL+SC10mL

42℃±1℃，18h～24h36℃±1℃，18h～24h

BSXLD（或HE、显色培养基）

36℃±1℃，40h～48h36℃±1℃，18h～24h

挑取可疑菌落

TSI，赖氨酸，NA，靛基质，尿素(pH7.2)，KCN

HS+靛基质-HS-靛基质-尿

生化鉴定试剂盒或全2HS+靛基质+2反应结果与左

2

尿素-KCN-素-KCN-侧描述不符

自动微生物生化鉴定尿素-KCN-

赖氨酸+赖氨酸+/-

系统+赖氨酸+

甘露醇+、山梨醇+ONPG-

沙门氏菌，血清学试验非沙门氏菌

报告

图1沙门氏菌检验程序

5操作步骤

5.1前增菌

称取25g（mL）样品放入盛有225mLBPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质

1min～2min，或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样

品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定pH值，用1mol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2。

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GB4789.4—2010

无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养8h～

18h。

如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15min,或2℃～5℃不超过18h解冻。

5.2增菌

轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mLTTB内，于42℃±1℃培养18h～24

h。同时，另取1mL，转种于10mLSC内，于36℃±1℃培养18h～24h。

5.3分离

分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂

平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于36℃±1℃分别培养18h～24h（XLD琼脂平板、HE琼脂

平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或40h～48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落,

各个平板上的菌落特征见表1。

表1沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征

选择性琼脂平板沙门氏菌

BS琼脂菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些

菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。

HE琼脂蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或

几乎全黑色。

XLD琼脂菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或

呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。

沙门氏菌属显色培养基按照显色培养基的说明进行判定。

5.4生化试验

5.4.1自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，

再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃

培养18h～24h，必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属

的反应结果见表2。

表2沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果

三糖铁琼脂初步判断

赖氨酸脱羧酶试验培养基

斜面底层产气硫化氢

KA＋（－）＋（－）＋可疑沙门氏菌属

KA＋（－）＋（－）－可疑沙门氏菌属

AA＋（－）＋（－）＋可疑沙门氏菌属

AA＋/－＋/－－非沙门氏菌

KK＋/－＋/－＋/－非沙门氏菌

注：K：产碱，A：产酸；＋：阳性，－：阴性；＋（－）：多数阳性，少数阴性；＋/－：阳性或阴性。

5.4.2接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试

验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑

取可疑菌落接种。于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。将已挑菌

落的平板储存于2℃～5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查。

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表3沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

反应序号硫化氢靛基质pH7.2尿素氰化钾赖氨酸脱羧酶

（H2S）（KCN）

A1＋－－－＋

A2＋＋－－＋

A3－－－－＋/－

注：＋阳性；－阴性；＋/－阳性或阴性。

5.4.2.1反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1

项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。

表4沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

pH7.2尿素氰化钾（KCN）赖氨酸判定结果

脱羧酶

－－－甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）

－＋＋沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特性）

＋－＋沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）

注：＋表示阳性；＋表示阴性。

5.4.2.2反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳

性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。

5.4.2.3反应序号A3：补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒

沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。

5.4.2.4必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别。

表5沙门氏菌属各生化群的鉴别

项目ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ

卫矛醇＋＋－－＋－

山梨醇＋＋＋＋＋－

水杨苷－－－＋－－

ONPG－－＋－＋－

丙二酸盐－＋＋－－－

KCN－－－＋＋－

注：＋表示阳性;－表示阴性。

5.4.3如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据5.4.1的初步判断结果，从营

养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动

微生物生化鉴定系统进行鉴定。

5.5血清学鉴定

5.5.1抗原的准备

一般采用1.2％～1.5％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。

O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如2％～3％）培养基上再检查；如果是由于

Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰

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上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在0.55％～0.65％半固体琼脂平板的中央，俟菌落

蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3％～0.4％半固体琼脂的小玻管1次～2

次，自远端取菌培养后再检查。

5.5.2多价菌体抗原（O）鉴定

在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上

部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对

照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1min，并对

着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。

5.5.3多价鞭毛抗原（H）鉴定

同5.5.2。

5.5.4血清学分型（选做项目）

5.5.4.1O抗原的鉴定

用A～F多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形

菌株，不能分型。

被A～F多价O血清凝集者，依次用O4；O3、O10；O7；O8；O9；O2和O11因子血清做凝集

试验。根据试验结果，判定O群。被O3、O10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19单因

子血清做凝集试验，判定E1、E2、E3、E4各亚群，每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因

子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。

不被A～F多价O血清凝集者，先用9种多价O血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种

血清所包括的O群血清逐一检查，以确定O群。每种多价O血清所包括的O因子如下：

O多价1A，B，C，D，E，F，群（并包括6,14群）

O多价213，16，17，18，21群

O多价328，30，35，38，39群

O多价440，41，42，43群

O多价544，45，47，48群

O多价650，51，52，53群

O多价755，56，57，58群

O多价859，60，61，62群

O多价963，65，66，67群

5.5.4.2H抗原的鉴定

属于A～F各O群的常见菌型，依次用表6所述H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。

表6A～F群常见菌型H抗原表

O群第1相第2相

Aa无

Bg,f,s无

Bi,b,d2

C1k,v,r,c5,z15

C2b,d,r2,5

D（不产气的）d无

D（产气的）g,m,p,q无

E1h,v6,w,x

E4g,s,t无

E4i

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不常见的菌型，先用8种多价H血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种

血清所包括的各种H因子血清逐一检查，以第1相和第2项的H抗原。8种多价H血清所包括的H

因子如下：

H多价1a，b，c，d，i

H多价2eh，enx，enz15，fg，gms，gpu，gp，gq，mt，gz51

H多价3k，r，y，z，z10，lv，lw，lz13，lz28，lz40

H多价41,2；1,5；1,6；1,7；z6

H多价5zz，zz，zz，z，z，z，z

42342443229353638

H多价6z39，z41，z42，z44

H多价7z52，z53，z54，z55

H多价8z56，z57，z60，z61，z62

每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果，没有H单因子血清的要用两

个H复合因子血清进行核对。

检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的,可

在琼脂斜面上移种1～2代后再检查。如仍只检出一个相的H抗原，要用位相变异的方法检查其另一

个相。单相菌不必做位相变异检查。

位相变异试验方法如下：

小玻管法：将半固体管（每管约1mL～2mL）在酒精灯上溶化并冷至50℃，取已知相的H

因子血清0.05mL～0.1mL，加入于溶化的半固体内，混匀后，用毛细吸管吸取分装于供位相变异试

验的小玻管内，俟凝固后，用接种针挑取待检菌，接种于一端。将小玻管平放在平皿内，并在其旁

放一团湿棉花，以防琼脂中水分蒸发而干缩，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端

挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细

菌的动力不能抑制。一般按原血清1：200～1：800的量加入。

小倒管法：将两端开口的小玻管（下端开口要留一个缺口，不要平齐）放在半固体管内,小玻

管的上端应高出于培养基的表面，灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化，冷至50℃，挑取因子

血清1环，加入小套管中的半固体内，略加搅动，使其混匀，俟凝固后，将待检菌株接种于小套管

中的半固体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可从套管外的半固体表面取菌检查，或

转种1％软琼脂斜面，于37℃培养后再做凝集试验。

简易平板法：将0.35％～0.4％半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清1环，滴在半固体

平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓

延生长的菌苔边缘取菌检查。

5.5.4.3Vi抗原的鉴定

用Vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌,都柏林

沙门氏菌。

5.5.4.4菌型的判定

根据血清学分型鉴定的结果，按照附录B或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。

6结果与报告

综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g（mL）样品中检出或未检出沙门氏菌。

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附录A

（规范性附录）

培养基和试剂

A.1缓冲蛋白胨水（BPW）

A.1.1成分

蛋白胨10.0g

氯化钠5.0g

磷酸氢二钠（含12个结晶水）9.0g

磷酸二氢钾1.5g

蒸馏水1000mL

pH