GBZ/T(卫生) 240.10-2011 化学品毒理学评价程序和试验方法 第10部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验

ICS13.100

C52

中华人民共和国国家职业卫生标准

/—

GBZT240.102011

化学品毒理学评价程序和试验方法

:

第部分体外哺乳动物细胞

10

ㅤㅤㅤㅤ

基因突变试验

—

Proceduresandtestsfortoxicoloicalevaluationsofchemicals

g

:

Part10Invitromammaliancellforwardenemutationtest

g

2011-08-19发布2012-03-01实施

中华人民共和国卫生部发布

/—

GBZT240.102011

化学品毒理学评价程序和试验方法

:

第部分体外哺乳动物细胞

10

基因突变试验

1范围

/、、、

GBZT240的本部分规定了体外哺乳动物细胞基因突变试验的目的试验概述试验方法数据处

、。

理与结果评价评价报告和结果解释

本部分适用于检测化学品引起的体外哺乳动物细胞基因突变。

2规范性引用文件

。,

下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件仅所注日期的版本适用于本

。,()。

文件凡是不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于本文件

/职业卫生名词术语

GBZT224

/:

化学品毒理学评价程序和试验方法第部分总则

GBZT240.11

3术语和定义ㅤㅤㅤㅤ

/界定的术语和定义适用于本文件。

GBZT240.1

3.1

突变频率mutantfreuenc

qy

所观察到的突变细胞集落数与存活细胞数之比值。

4试验目的

(、

通过检测受试化学品诱发体外培养的哺乳动物细胞基因突变包括碱基对置换移码突变和缺失

),。

等的能力从而评价受试化学品的致突变性及其强度

5试验概述

,,,

在加入或不加入肝微粒体酶的条件下使细胞暴露于受试样品一定时间然后将细胞传代培养突

变细胞在含有巯基鸟嘌呤(,)或三氟胸苷(,)的选择性培

6-6-thiouanine6-TGtrifluorothmidineTFT

gy

。,。

养液中能继续分裂并形成集落根据突变集落数可计算突变频率从而评价受试样品的致突变性

6试验方法

6.1受试样品配制

,,,

选定受试样品的合适溶剂首选无菌双蒸水作为溶剂如果不溶于水的或水溶性低的化学品首选

1

/—

GBZT240.102011

。,;

二甲基亚砜固体受试样品需溶解或悬浮于溶剂中用前稀释至适合浓度液体受试样品可以直接加入

/。。

试验系统或用前稀释至适合浓度受试样品一般应在使用前新鲜配制

6.2剂量水平

。,

至少应设置个可供分析的剂量对有细胞毒性的受试样品高剂量组的细胞存活率可为

410%~

,。,/,/

20%低剂量组的细胞存活率应>80%无细胞毒性的受试样品高剂量应达到5LmL5mmL或

μg

/。,

0.01molL应在预试验中确定细胞毒性和溶解度测定细胞毒性可使用指示细胞完整性和生长情况

,,系统存在或不存在的条件下测定细胞毒性。

的指标如相对集落形成率或相对细胞生长率等应在S

9

6.3对照

6.3.1阳性对照

不需代谢活化的阳性对照物

6.3.1.1S

9

———甲磺酸乙酯(,号);

ethlmethanesulhonateCAS62-50-0

yp

———甲磺酸甲酯(,号);

methlmethanesulhonateCAS66-27-3

yp

———(,)。

乙基亚硝基脲号等

ethlnitrosoureaCAS759-73-9

y

需要代谢活化的阳性对照物

6.3.1.2S

9

———3-甲基胆蒽(,号);

3-methlcholanthreneCAS56-49-5

y

———环磷酰胺(,号);

cclohoshamideCAS50-18-0

ypp

———亚硝基胍(,号);

N-N-nitrosodimethlamineCAS62-75-9

-y

ㅤㅤㅤㅤ

———,二甲基苯蒽(,,号);

712-712-demethlbenzanthraceneCAS57-97-6

y

———()((),)。

苯并芘号等

αbenzoareneCAS50-32-8

py

6.3.2阴性对照

6.3.2.1溶剂对照

,,。

溶剂应为非致突变物不与受试样品发生化学反应不影响细胞存活和活性首选溶剂是水或

S

9

,(),。

水溶性溶剂亦可使用二甲基亚砜DMSO但浓度不应大于0.5%

6.3.2.2空白对照

如果没有文献资料或历史资料证实所用溶剂无致突变作用时应设空白对照。

6.4细胞株

,

用于本试验的细胞株对化学致突变物应具有明确的敏感性高度的繁殖能力以及稳定的自发突变

。,。

率应检测细胞是否被支原体感染若已被感染则不能使用

位点突变分析常使用中国仓鼠肺细胞株()和中国仓鼠卵巢细胞株(),位点突

HPRTV79CHOTK

变分析常用小鼠淋巴细胞株()和人类淋巴细胞细胞株(,等)。

L5178YTK6WTK1

6.5试剂配制

6.5.1完全培养液

。,

应根据试验所用系统和细胞类型来选择适宜的培养基对于或细胞常用

L5178YTK6PRMI

(/、/)。

1640培养基加入10%马血清和适量抗菌素青霉素100IUmL链霉素100mL对于V或

μg79

2

/—

GBZT240.102011

,()。

CHO细胞常用MEMEale培养基加入10%胎牛血清和适量抗菌素

g

6.5.2血清处理

,,,

将过滤除菌后的小牛血清或马血清放入56℃水浴中保温30min以灭活补体然后分装保存于

-20℃备用。

6.5.3代谢活化系统

肝微粒体酶(混合液)。

S

9

(,)

无钙镁的磷酸盐缓冲液无钙镁为成分

6.5.4PBSH7.2~7.4

p

磷酸二氢钾()

KHPO0.20g

24

磷酸氢二钠(·)

NaHPO12HO2.89g

242

氯化钾()

KCl0.20g

氯化钠()

NaCl8.00g

()

双蒸水压力蒸气灭菌

1000mL

6.5.5胰蛋白酶-EDTA溶液

,,

分别用无钙镁PBS配制胰蛋白酶与EDTA钠盐溶液胰蛋白酶溶液浓度为0.05%EDTA钠盐溶

,,。

液浓度为0.02%两溶液按1∶1混合存放于-20℃冰箱备用

6.5.6姬姆萨染液

ㅤㅤㅤㅤ

,,。,,

取姬姆萨染料3.8g置玛瑙乳钵中加少量甲醇研磨逐渐加甲醇至375mL待完全溶解后再加

,。,。,,

125mL甘油放入37℃温箱中保温48h保温期间振摇数次使充分溶解取出过滤2周后使用作

。,,//()。

为姬姆萨染液原液使用时取份姬姆萨染液原液与份磷酸盐缓冲液混合

19115molLpH6.8

6.5.7选择剂

巯基鸟嘌呤()建议使用最终浓度为/;三氟胸苷()建议使用最终浓度为

6-6-TG5mLTFT

μg

/。

3mL

μg

6.6试验步骤

位点突变分析()

6.6.1HPRTV79

6.6.1.1细胞准备

5

,,

将个细胞接种于含完全培养液的直径为的平皿中除未处理对照组外每组个

5×10100mm3

。。

平皿于37℃CO2培养箱中培养24h

6.6.1.2接触受试样品

,。,

吸去上述供试培养皿中的培养液用无钙镁洗次将含有细胞的培养皿分为两大组一组

PBS2

,。,,

加混合液另一组不加混合液加混合液组在培养皿中加入混合液对不加混合

SSS2mLSS

99999

,,,

液组则用2mL无血清培养液代替再加不同剂量受试样品的供试液最后不含血清的培养液补足至

,。,,

10mL并将培养皿置CO2培养箱中培养3h~6h处理结束后吸去培养皿中液体部分用无钙镁

,,。

洗涤细胞次再加入完全培养液在培养箱中培养阳性和阴性对照组也

PBS210mLCO219h~22h

,。

分为加与不加S混合液两个组操作方法同上

9

3

/—

GBZT240.102011

6.6.1.3表达

,,,。、

将培养物用胰蛋白酶-EDTA消化待细胞脱落后加入完全培养液终止消化混匀计数并进行

5

。,。,

表达和细胞毒性测定表达时以5×10个细胞接种于直径为100mm的平皿中培养6d~8d后

,5,()。

分传一次仍接种个细胞培养后再进行突变体的选择及集落形成效率的测定

5×103dCFE

6.6.1.4细胞毒性测定

,,,培养箱内培养。

将上述消化计数后的细胞每个平皿接种个每组个平皿于7d

200537℃CO2

,,。。

取出样本固定并进行姬姆萨染色后计数各平皿的细胞集落数以相对CFE值表示细胞的毒性

6.6.1.5突变体的选择及集落形成率的测定

5

,,,,。

表达结束后消化细胞分别接种每组个平皿每个平皿接种个细胞待细胞贴壁后加

52×10

,/。。,

入6-TG终浓度为5mL放入CO培养箱培养7d~10d固定后进行姬姆萨染色计数平皿内

μg2

,()。

集落数并计算其突变频率MF

6.6.2TK位点突变分析

,5/,,。

6.6.2.1取生长良好的细胞调整密度为5×10mL按1%体积加入受试样品37℃震摇处理3h

,,,

离心弃上清液用或不含血清的培养基洗涤细胞遍重新悬细胞于含马血清的

PBS210%PRMI

,5/。

1640培养液中并调整细胞密度2×10mL

(),/,

天的平板接种效率测定取适量细胞悬液作梯度稀释至个细胞接种孔

6.6.2.2PE08mL96

0

(,/),,,,

板每孔加即平均个细胞孔每个剂量作块块板饱和湿度条件下

0.2mL1.61~237℃5%CO2

ㅤㅤㅤㅤ

,。

培养12d计数每块平板的集落生长的孔数

,

表达对步骤所得细胞悬液作表达培养每天计数细胞密度并保持密度在

6.6.2.36.6.2.12d

6/以下。

10mL

(),,

第的平板接种效率测定第天表达培养结束后取适量细胞悬液按步骤

6.6.2.4PE2d26.6.2.2

2

,。

作稀释梯度并接种孔板培养后计数每块平板有集落生长的孔数

9612d

(),,

抗性突变频率测定第天表达培养结束后取适量细胞悬液调整细胞密度为

6.6.2.5TFTMF2

4

/,(,/),,(,即平均

加入三氟胸苷终末浓度为混匀接种孔板每孔加

1×10mLTFT3mL960.2mL

μg

/),,,,,

个细胞孔每个剂量作块块板饱和湿度条件下培养计数有突变集

20002~437℃5%CO212d

落生长的孔数。

7数据处理与结果评价

7.1HPRT位点突变分析按下列公式计算有关指标

———/;

绝对CFE=形成集落数接种细胞数

———(/);

相对CFE=试验组绝对CFE溶剂对照组绝对CFE×100%

———()(/)(/);

突变频率MF=突变集落数接种细胞数×1绝对CFE

2

———试验结果用检验进行统计学处理。

Χ

7.2TK位点突变分析按下列公式计算有关指标

平板效率(和PE)

7.2.1PE2

0

平板效率计算见公式()。

1

4

/—

GBZT240.102011

(/)

-InEWTW

…………()

PE=1

1.6

式中:

EW———无集落生长的孔数;

TW———总孔数;

———每孔接种细胞。

1.6

7.2.2相对存活率

相对存活率计算见公式()。

2

()

PE0处理

相对存活率(,)…………()

RSR%=×100%2

()

PE0对照

突变频率()

7.2.3MF

突变频率计算见公式()。

3

(/)/

6-InEWTWn

()…………()

MF103

×=

1.6

式中:

EW———无集落生长的孔数;

TW———总孔数;

n———每孔接种细胞数()。

2000

7.3评价原则

ㅤㅤㅤㅤ

7.3.1在下列两种情况下可判定受试样品在本试验系统中为阳性结果:

———、。

受试样品引起突变频率的增加具有统计学意义并有剂量效应关系

-

———,,。

受试样品在任何一个剂量条件下引起具有统计学意义并有可重复性的阳性反应

阴性结果的判定需在相对存活率(,)(即已产生明显细胞毒性)

7.3.2relativesurvivalrateRSR<20%

。。

的情况下未见突变频率显著增加时方可作出评价时应综合考虑生物学和统计学意义

8评价报告

/,:

除GBZT240.1规定的一般项目外评价报告还应包括以下内容

)、(、);

a所用溶剂及其配制剂量选择应说明受试样品的细胞毒性测定方法溶解情况等

)细胞株名称;

b

)试验条件和方法:

c

———、;

阳性对照物名称和使用浓度混合液的制备与配方

S

9

———、;

所用培养液名称血清类别和使用浓度

———接种时的细胞密度以及所用培养瓶的规格;

———受试样品与试验系统的接触时间;

———表达时间;

———结果评价方法。

)结果:

d

———,、、(

受试样品高剂量的确定及结果包括细胞毒性的测定溶解情况对pH的影响如果有影

响);

———剂量组和对照组的突变频率及统计结果;

5

/—

GBZT240.102011

———(,),

阳性对照组和阴性对照组包括常用溶剂如DMSO在本实验室历史上突变频率范围

();

均值和标准差说明样品数

———结论。

9结果解释

。

阳性结果表明在本试验条件下受试样品可引起所用哺乳动物细胞的基因突变阴性结果表明在本

试验条件下受试样品不引起所用哺乳动物细胞的基因突变。

ㅤㅤㅤㅤ

6