GB/T 18641-2002 伪狂犬病诊断技术

GB1T18641-2002

前言

伪狂犬病(pseudorabies,YR;Aujeszky'sdisease,AD)是危害猪、牛、羊、狗、猫、家兔等多种家畜和

野生动物的一种急性传染病。除猪以外的动物感染伪狂犬病病毒后，主要是以发热、奇痒和脑脊髓炎症

状为特征.以死亡为结局，并呈散发形式。本病对养猪业危害最大，猪感染后可引起妊娠母猪流产、产死

胎和木乃伊胎;仔猪大量死亡，15日龄内死亡率为100%,断奶仔猪死亡率10%-20%，种猪不育，母猪

返情，空怀，公猪翠丸发炎肿胀、萎缩、失去种用能力;育肥猪增重缓慢、饲料报酬降低。本病呈世界性分

布。

本标准规定的病原学诊断方法主要用于死亡动物的病料检测和活体动物的鼻拭子样品检测，其中

聚合酶链反应具有快速、灵敏的特点，可用于大批样品的检测。血清学诊断主要用于非免疫动物的诊断、

血清流行病学调查和免疫动物的抗体水平监测。中和试验特异性强，是国际通用的法定方法，可用于日

岸进出口检疫;胶乳凝集试验，简便快速、敏感性高、特异性强，适用于基层现场检测;酶联免疫吸附试验

适用于实验室大批样品检查、产地检疫、流行病学调查和无本病健康猪群的建立。

本标准的附录A、附录B、附录C、附录D都是标准的附录，附录E是提示的附录。

本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。

本标准由华中农业大学畜牧兽医学院负责起草，农业部动物检疫所参加起草

本标准主要起草人:陈焕春、何启盖、李晓成、吴斌、方六荣、金梅林、邱德新、吴美州。

中华人民共和国国家标准

GB/T18641--2002

伪狂犬病诊断技术

DiagnostictechniquesforAujeszk'sdisease

1范围

本标准规定了伪狂犬病的诊断方法

本标准适用于猪、羊、犬、猫等及其他易感动物伪狂犬病的诊断。其中病毒分离鉴定、聚合酶链式反

应、家兔接种试验适用于伪狂犬病病毒的检测;中和试验、酶联免疫吸附试验适用于非免疫动物伪狂犬

病抗体的检测以及免疫后抗体水平的监测;胶乳凝集试验适用于实验室和现场对伪狂犬病抗体的早期

检测。

2病毒分离鉴定

2门试验材料

改良最低要素营养液((DMEM)培养基配方见附录A(标准的附录)，仓鼠肾细胞(BHK2,)或猪肾细

胞系((PK-15)细胞，新生犊牛血清，青霉素，链霉素，。.22pm微孔滤膜，细胞培养瓶。

2.2操作步骤

2.2门病料的采集对死亡病畜或活体送检并处死的动物，以无菌手术采集大脑、三叉神经节、扁桃体、

肺等组织，冷藏送实验室检测

2.2.2样品处理:待检组织在灭菌乳钵内剪碎，加入灭菌玻璃砂研磨，用灭菌生理盐水或DMEM培养

液(见附录A〕制成I，5乳剂，反复冻融三次，经3000r/min离心30min后，取上清液经0.22pm微孔

滤膜过滤，加人青霉素溶液至最终浓度为300lU/m工一、链霉素为100pg/ml，一70℃保存作为接种

材料

2.2.3病料接种:将病料滤液接种已长成单层的BHK细胞(或PK-15细胞)，接种量为培养液量的

10Y,37C恒温箱中吸附1h，加人含10%新生犊牛血清(已经过56(’水浴灭活30min，过滤除菌，无支

原体)的DMEM培养液，置37C温箱中培养。

2.2.4观察结果:接种后364-72h，细胞应出现典型的细胞病变效应((CPE)，表现为细胞变圆，拉网、

脱落。如第一次接种不出现细胞病变，应将细胞培养物冻融后盲传三代，如仍无细胞病变，则判为伪狂犬

病病毒检测阴性

2.2.5病毒的鉴定:将出现细胞病变的细胞培养物，用聚合酶链反应或家兔接种试验，或作进一步

鉴定。

3聚合酶链反应

3.1试验材料

蛋白酶K,f一二烷基硫酸钠(SDS)，苯酚，三氯甲烷，异戊醇(分析纯)，澳化乙锭(EB),TEN缓冲液

见〔附录B(标准的附录)〕。

引物:扩增伪狂犬病毒基因中434-651碱基对((bp)之问217by基因片段，序列为V-游引物III

中华人民共和国国家质f监督检验检疫总局2002-02-19批准2002-05-01实施

GB/T18641-2002

5'-('AGGAGGACGA(;CTGGGGCT-3'，下游引物P2:5'-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3'o

3.2操作步骤

32.飞样品的采集:对于病死或扑杀动物，取大脑和三叉神经节、扁桃体、肺等组织;对于待检活猪，用

已灭菌的棉签，伸人猪鼻腔中，采取鼻粘液，即为鼻拭子，冷藏条件下送实验室检测。

3.2.2样品处理每份样品分别处理。采病料经组织研磨器充分研磨，按I:5用TEN缓冲液(见附

录B中131)悬浮收集于离心管内，反复冻融3次，7000r/min离心5min，如样品为鼻拭子，则加入

2nli,TEN缓冲液充分挤压，取出棉拭子，7000r/min离心5min，取上清液472.5川，加人25可Io%

1一二烷基硫酸钠(见附录“中B4)和2.5pI的20mg/mI蛋自酶K(见附录B中B3),50C水浴摇床上

放置2h后加人等量的饱和酚溶液500川，涡旋20s离心取上清液，加等量的酚三氯甲烷，异戍醇

(25:24:1)抽提一次，再用等量的三氯甲烷:异戍醇(24:1)抽提一次，最后用两倍的无水乙醇沉淀，真

空抽干后加人201,1双蒸水溶解(此即为“模板”)，一20C贮存备用。

12.3聚合酶链反应(PCK)的操作程序:先将制备的模板DNA置100C水浴10mm作变性处TJ，然

后立即放于冰浴中PCR反应体系(按摩尔浓度计算)为:总体积25川，含有50mmol/l.(氯化钾)

(KCI),10mmol/I，三经甲基氨基甲烷一盐酸C(hris-HCD(pH9.0),0.1%-.I甲基氨基甲烷溶液(0.7%

TritonX-100),100pmol/LdNTPs,0.35pmol/I引物，2mol/I氯化镁(Mgcl')，及0.5U台克(Tay)

DNA聚合酶,20I模板DNA

最后加人矿物油约20川覆盖

扩增条件为:94C变性3min，进人循环，94C60s,65C60s,72('60s,40个循环后72C延伸5min

12.4PCR产物的检测:将样品分别加于1%琼脂凝胶板的各样品孔中，有一孔加标准阳性样品，每孔

10川一15川_PCR扩增产物，进行电泳，澳化乙锭(见附录B中B2)染色，在紫外光下观察结果。电泳区

带迁移率与标准阳性样品区带迁移率相同的待检样品应判为阳性为进一步进行PCR扩增产物的特异

性鉴定，可取PCR产物用SalI酶切，酶切产物在20o琼脂糖凝胶上电泳，澳化乙锭染色，在紫外光下观

察并与标准分子量相对照，阳性样品可出现140by和77by两个片段

4家兔接种试验

4.1家兔的选择

选择健康成年家兔，用血清中和试验、胶乳凝集试验、琼脂扩散试验或酶联免疫吸附试验检测，证实

为伪狂犬病抗体阴性。

4.2病料的采集及处理

无菌采集疑为该病死亡或扑杀动物的脑组织、扁桃体、淋巴结，混合后剪碎，用组织匀浆器研磨，用

火菌生理盐水配成1，5乳悬液，反复冻融2-3次后，以3000r/min离心10min，取上清液加人青霉素

和链霉素溶液，最终浓度分别为100IU/mL和100leg/mL,置4C冰箱中作用12h，作为待检样品。

4.3病料接种

将待检样品经颈部皮下注射接种，每只家兔接种1m工一2mL,

4.4结果观察和判定

4.4.1伪狂犬病毒感染阳性:被接种动物在接种后24h-48h注射部位出现奇痒，家兔啃咬注射局

部，导致皮肤溃烂，家兔尖叫、口吐白沫，最终死亡

4.4.2伪狂犬病毒感染阴性:接种家兔仍健活，判为阴性。

5血清中和试验

5门试验材料

0.25/"0胰酶(胰蛋白酶250mg加人100ml汉克氏(Hanks)液中，充分溶解后，过滤除菌，20〔保

存),PK-15细胞;伪狂犬病阳性血清、阴性血清、伪狂犬病标准弱毒株;96孔细胞培养板

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5.2操作步骤

5.2.1病毒半数组织培养感染量(TCID,,)的测定

5.2.1门病毒培养和收获:将