GB/T 18641-2018 伪狂犬病诊断方法

ICS11.220

B41

国

中华人民共和国国家标准

G~/T18641-2018

代替GB/T18641-2002

伪狂犬病诊断方法

Diagnosticmethodforpseudorabies

2018-09-17发布2019-04-01实施

国家市场监督管理总局峪非

中国国家标准化管理委员会0(..'I(J

GB/T18641-2018

目u昌

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准代替GB/T18641-2002《伪狂犬病诊断技术》。与GB/T18641-2002相比，主要技术变化

如下：

增加了检测猪伪枉犬病病毒：gB抗体的阻断ELISA方法；

一一增加了检测伪狂犬病病毒野毒gE-PCR方法。

本标准由中华人民共和国农业农村部提州。

本标准由全同动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归｜二｜。

本标准起草单位：华中农业大学、中国动物卫生与流行病学中心。

本标准主要起草人：何启盖、库旭钢、吴斌、陈品、方六荣、李晓戚、姜雯、，需宪荣、范盛先、刘正飞、

吴发兴、吴美洲、陈焕春。

本标准所代替标准的历次版本发布情况为：

一一－GB/T18641-20020

I

GB/T18641-2018

5.4.4操作步骤

5.4.4.1稀释待检血清

用样品稀释液将待检J(II.清、阴性1(11.清、阳性l(IL清作l:l倍稀释（即100µLJ(II请加100µL稀释液），

其中阴性1(11.清、阳性1(11.清等分别做2个重复，分别标记为A1、A2和B1、民。

5.4.4.2血清孵育

将稀释1(11.清100/.LL加入抗原孔中，18℃～26℃作用1h。

5.4.4.3洗涤

甩掉板孔中的溶液，每孔加300µL洗涤液，洗涤3次。

5.4.4.4加入酶标抗体

加入辣根过氧化物酣标记的抗猪伪狂犬病病毒gE单克隆抗体，室报(18℃～26。C）作用20min,

洗涤3次。

5.4.4.5加入底物

每孔方i1入100µLTMB底物洛液，室im'i脏光显色15min

5.4.4.6终止反应

50(LL终止液终止反应。

每孔加入

5.4.4.7读取眼光度值（00650)

在雨标仪土．于650nm波民条件下测定吸光度值。

5.4.4.8结果计算和判定

5.4.4.8.1对照组中，阴性1(11.清平均OD值减去阳性l(IL清平均OD值之差大于0.30时，试验有效。

5.4.4.8.2按式（3）计算待检1(11.清样品OD6so与阴性对照血清OD650之比CS/N）值：

sc

V

JA

飞口

O

//N--

－一

-

J

Nc..(3)

VA

式中：

SCx样品A650;

NCx一一一（A1ODsso+A2ODsso)I2。

5.4.4.8.3当S/N>0.70时，判为猪伪狂犬病病毒（gE）抗体阴性。

5.4.4.8.4当S/N<0.60时，判为猪伪狂犬病病毒（gE）抗体阳性。

5.4.4.8.5当S/N值为0.60～o.70时，判为猪伪狂犬病病毒（gE）抗体可疑。可于9d~14d后再来

l(IL，重复检测，如仍为可疑，fl]为阳性。

6病毒分商鉴定

6.1仪器

6.1.1高速冷冻离心机。

8

GB/T18641-2018

6.1.2组织匀浆器（或研钵）。

6.1.3生物安全柜。

6.1.4微量移液器。

6.2耗材

6.2.1直径为0.45µm滤膜的滤器。

6.2.2细胞培养瓶。

6.2.3吸管。

6.2.4移液器吸头。

6.3试剂

6.3.1DMEM培养基和0.25%膜隅溶液（见附录A）。

6.3.2磷酸盐缓冲液。

6.3.3仓鼠肾细胞系<BHK-21）或猪肾细胞系（PK-15）细胞。

6.3.4模牛1(11.清。

6.3.5青霉素。

6.3.6链霉素。

6.4操作步骤

6.4.1病料采集

对死亡病畜或活体送检处死的动物，采集脑组织（应含有三叉神经节）、肺脏和扁桃体等组织，2℃～

8℃冷藏条件下运输送检。

6.4.2样品处理

待检组织（可等体积1昆样或单独处理）剪碎井匀浆后，与DMEM制成1:5悬剂，反复冻融3次，

10000×g离心10min后，取上清液加双抗（青霉素榕液终浓度为300IU/mL、链霉素终浓度为

100µg/mL）过夜或4℃处理4h，再经孔径为0.45µm滤膜过泼、，－80℃保存作为接种材料。

6.4.3病料接种细胞

将病料~液接和1，至已长成单层的BHK-21细胞（或PK-15细胞），接和1，量为所力n培养液量的1/10,

37℃恒泪箱中吸附1h，加入含10%模牛1(11.清（｜。｜清要求元支原体污染，预先经56℃水浴灭活30min

后使用）的DMEM培养液，置37℃、5%C02培养箱中培养，逐日观察细胞病变。

6.4.4结果判定

接和1，后36h~72h，如细胞出现变同、拉网、脱落等现象，可初步判定阳性（病料中含有伪枉犬病病

毒）。如第一次接种未州砚细胞病变，应将细胞培养物冻融、后，按6.4.3盲传3代，如仍无细胞病变，判为

阴性（病料中元伪狂犬病病毒）。

6.4.5病毒鉴定

将出现细胞病变的细胞培养物，用已知的伪狂犬病毒阳性.rr11.清做病毒中和试验鉴定病毒，用聚合隅

链式反应（第7章）或家兔感染试验（第8章）进一步鉴定。

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GB/T18641-2018

7聚合酶链式反应

7.1仪器

7.1.1组织匀浆机（或研钵）。

7.1.2高速冷冻离心机。

7.1.3生物安全柜。

7.1.4PCR仪。

7.1.5凝胶成像系统。

7.1.6水浴锅。

7.1.7分析天平。

7.1.8微量移液器。

7.2耗材

7.2.1移液器吸头。

7.2.2EP管。

7.2.3PCR反应管。

7.3试剂

7.3.1DNA提取试剂盒。

7.3.2琼脂糖。

7.3.3TEN缓冲液（见附录A）。

7.3.4澳化乙链（EB)（见附录A）或新型核酸染料（EB替代物）。

7.4引物序列

7.4.1伪狂犬病病毒gD基因检测

引物序列：上游引物Pl:5'-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3＇，下游引物P2:51-GTCCACG

CCCCGCTTGAAGCT-3'o扩增靶序列是伪狂犬病病毒gD基因434～650nt间的片段，扩增产物大小

217bp。可用于检测伪狂犬病病毒，但不能区分猪伪狂犬病基因缺失活疫苗株和1野毒株。

7.4.2伪狂犬病病毒gE基因检测

引物序列：上游引物P3:5’-TTTGGATCCATGCGGCCCTTTCTG-3＇，下游引物P4:51-TTT

GAATTCTTACGACACGGCGTCGCA-3＇，扩增靶序列是伪征犬病病毒gE基因79～446nt间的片

段，扩增产物大小为368bp，能区分猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗株和野毒株。

7.5操伟步骤

7.5.1样品的采集

对于病死或剖杀的动物，取脑组织（含三叉神经节）、扁桃体等组织；对于待检活猪，用灭菌棉签伸入

猪鼻腔中（以棉签棉花部分全部捕入鼻腔为准），同一方向转动3次，获取鼻勃液，即为鼻拭子；用扁桃体

取样器采集成年和Ji猪扁桃体；采集公猪精液（检测前需用灭菌PBS做10倍稀释）。4℃～8℃冷藏条件

下运输送检。

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7.5.2样品处理与模板制备

组织病料用组织匀浆器或Wf-钵处理后，按1:5比例用TEN缓冲液（见附录A.3）充分泪悬，收集子

离心管内，反复冻融3次，10000×K离心10min；鼻拭子样品，则加入1mLTEN缓冲液涡旋10min

后挤压棉签，泪悬液10000×K离心5min，取上清液；精液样品，先用PBS做10千古稀释，方可用于核酸

提取。

取组织或鼻拭子样品的上清液或稀释好的精液，按DNA试剂盒说明书提取DNA模极，20℃贮

存备用。

7.5.3聚合酶链式反应（PCR）的操作程序

7.5.3.1扩增伪狂犬病gD基因PCR反应体系

总体积25.0µL,MIX12.51.1L，引物Pl,PZ各1.0µLOO,umol/L),H205.5,uL,DNA模板5.0µL。

扩增条件为：94℃预变性5min;94℃30s,65℃30s,72°C30s,35个循环后72℃延伸10mino

7.5.3.2扩增伪狂犬病gE基因PCR反应体系

总体积25.0r1L,MIX12.5µL，引物P3、P4各1.0µLOO,umol/L),H205.5,uL,DNA模极5.0µL。

扩增条件为：94℃预变性5min;94℃30s,60℃30s,72℃30s,35个循环后72℃延伸10min。

7.5.4PCR产物的检测与判定

7.5.4.1将8µL~10µLPCR扩增产物加入含有澳化乙链（EB）或新型核酸染料（作为EB替代物）的

1%琼脂糖凝胶的各电泳孔中（设阳性和阴性样品扩增对照孔），电咏后，在凝胶成像系统或紫外光下观

察结果。

7.5.4.2当阳性对照和被检样品的扩增产物大小为217bp（必要时需要测序，目的序列参见附录D)，可

判定为伪狂犬病病毒阳性，但不能区分gE基因缺失疫苗毒株和野毒株。

7.5.4.3当阳性对照和被检样品的扩增产物大小为368bp（必要时需要iJ!rJ序，目的序列参见附录D），可

判定被检样品为伪狂犬病病毒野毒阳性。如不由现该扩增产物，但满足7.5.4.2中的阳性结果，判定被

检样品为gE基因缺失疫苗毒株，再则，判为扩增反应失败。

8家兔感染试验

8.1试验目的及生物安全要求

本法用于疑似伪狂犬病患病动物组织检测和分离病毒的鉴定。要求在有良好隔离条件和消毒措施

的动物房实施，试验结束后要对场地和用具实施彻底消毒。

8.2家兔的选择

选择健康成年家兔（至少4只），经J(II清中和试验或胶乳凝集试验证实为伪狂犬病病毒抗体阴性。

8.3病料的采集、处理及接种

元菌采集病猪扁桃体或患病动物脑组织（含有三叉神经节），用生理盐水或PBS液制成20%～30%

匀浆液，反复冻融3次后10000×K离心10min，取1mL~2mL上清液颈部皮下接和1，家兔（2只）；如

接种物为疑似伪狂犬病病毒的细胞培养物，则取1mL~2mL，同样皮下接种家兔（2只）。同时设立接

和1，等量生理盐水或PBS或培养基的对照家兔。

11

GB/T18641-2018

8.4结果观察和判定

8.4.1伪狂犬病病毒阳性

接和，，后24h~48h，家兔在注射部位出现奇痒，表现为家兔舔（啃）咬注射局部，导致皮肤苦苦烂；呼吸

困难、尖叫、四肢麻痹、痊孪等症状，病程2d~5d，最终死亡。对照家兔元任何临床症状，健活。可初步

判定病料或细胞培养物中含有伪狂犬病病毒。

8.4.2伪狂犬病病毒阴性

在接种后l周，病料悬液或细胞培养物接种家兔不耐现任何症状，健活；同时，对照家兔元任何临床

症状，健活。可判定病料（或细胞培养物）中不含伪枉犬病病毒。

9综合判定

当5.4.4.8结果阳性，可判定为猪伪狂犬病野毒感染抗体阳性；当7.5.4.2结果为阳性，可判定为伪

狂犬病野毒病原阳性。其余各项结果为阳性，可判断为伪狂犬病病毒感染（或免疫）阳性，但无法区分是

疫苗毒株还是野毒株所致。

12

GB/T18641-2018

附录A

（规范性附录）

细胞培养和PCR反应常用溶液配制

A.1DMEM培养液配制

A.1.1量取去离子水950mL，置于一定的容器中。

A.1.2将10.0gDMEM粉剂加于15℃～30℃的去离子水中，边力u:itl搅拌。

A.1.3每1000mL培养液力U3.7g碳酸氢铀（NaHCO，）。

A.1.4加水至1000mL，用1mol/LNaOH或HCI调pH值至6.9～7.0，在过滤前应盖紧容器瓶塞。

A.1.5用0.22µm的微孔滤膜正压过滤除菌。4℃保存备用。

A.20.25%膜酶溶液配制

膜蛋内附250.00mg加入100mLHanks液中，充分溶解后，用0.22µm的微孔滤膜正压过洁、除

菌，一20℃保存。

A.3TEN缓冲液配制

依次称量下列成分，充分混合溶解，即可。

三捏甲基氨基甲炕－盐酸（Tris-HCI)(pH8.0)1210.00mg(lOmmol/L)

乙二胶四乙酸（EDTA)(pH8.0)372.00mgO.Ommol/L)

1000mL

三蒸水

A.4j臭化乙键溶液配制

？臭化乙链1.0g

100mL

三蒸水

用