GB/T 21674-2008 猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法

ICS11.220

B41

中华人民共和国国家标准

GB/T21674—2008

猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法

Detectingporcinecircoviruswithpolymerasechainreaction

2008-04-09发布2008-06-01实施

发布

GB/T21674—2008

前言

本标准附录A为规范性附录。

本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。

本标准起草单位:农业部兽医诊断中心。

本标准主要起草人：出克恭、王宏伟、孙明、王传彬、陈西钊。

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GB/T21674—2008

引言

猪圆环病毒依据其致病性和基因组差异分为无致病性的猪圆环病毒I型(porcinecircovirustypel,

PCV-1)和有致病性的猪圆环病毒II型(porcinecircovirustype2,PCV-2)。PCV-2是引发仔猪断奶后多

系统衰弱综合征(post-wcaningmultisystemwastingsyndrome,PMWS)的主要病原。该病主要以患畜

生长迟缓、进行性消瘦和多系统病理损伤为特征，给世界各国主要养猪地区的规模化养猪业造成了一定

的经济损失。

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GB/T21674—2008

猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法

1范围

本标准规定了猪圆环病毒（PCV）聚合酶链反应（PCR）检测方法的技术要求。

本标准适用于猪血清和组织中的猪圆环病毒检测，以及其I型（Pcv-1）和n型（Pcv-2）的鉴别。

2实验室生物安全要求

试验操作应在生物安全II级（BSL-2级）以上的实验室进行。

3实验材料、仪器设备和试剂

3.1实验材料

眼科剪、眼科银、称量纸、10mL一次性注射器、1.5mL灭菌离心管、0.2mL薄壁PCR管、琼脂糖、

500mL量筒、500mL锥形瓶、吸头（10»L、200卩L、1000卩L）、灭菌双蒸水。

3.2仪器设备

分析天平、高速离心机、真空干燥器、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析

仪）、液氮罐或一70冰箱、微波炉、组织研磨器、一2（T冰箱、水浴锅、可调移液器（最大量程为2卩L、

20卩L、200mL,1000ML）0

3.3试剂

本标准所用试剂，除特殊标注外，均为分析纯。

3.3.1消化液（见第A.1章）。

3.3.22%蛋白酶K溶液（见第A.2章）。

3.3.3酚-三氯甲烷-异戊醇混合液（见第A.3章）。

3.3.42.5mmol/LdNTP（见第A.4章）。

3.3.510pmol/MLPV引物（见第A.5章）。

3.3.60.5U/mLTaqDNA聚合酶（见第A.6章）。

3.3.710倍PCR缓冲液（见第A.7章）。

3.3.8漠化乙锭（EB）溶液（见第A.8章）。

3.3.9电泳缓冲液（50倍）（见第A.9章）。

3.3.101%琼脂糖凝胶（见第A.10章）。

3.3.11上样缓冲液（见第A.H章）。

3.3.12异丙醇。

3.3.1375%乙醇（见第A.12章）。

3.3.1415mmoL/L氯化镁（见第A.13章）。

3.3.15灭菌双蒸水（见第A.14章）。

3.3.16电泳缓冲液（1倍）（见第A.15章）。

4操作程序

4.1样品的采集与处理

4.1.1样品的采集：濒死猪、扑杀的成年猪和流产胎儿取肺脏和淋巴结；幼龄猪取心脏；待检活猪，用

注射器取血2mL〜4mL,立即送往实验室。

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GB/T21674—2008

4.1.2样品的处理：每份样品分别处理

4.1.2.1组织样品处理：取待检病料约0.2g置研磨器中剪碎并研磨，加入2mL消化液（3.3.1）继续

研磨。取已研磨好的待检病料上清100卩L,置1.5mL灭菌离心管中，再加入500“L消化液（3.3.1）和

10卩L2%蛋白酶K溶液（3.3.2）,混匀后，置55水浴中4h〜16ho

4.1.2.2血清样品处理：待血液凝固后，取上清放于离心管中，4°8000g离心5min,取上清100ML,

置1.5mL灭菌离心管中，加入500mL消化液（3.3.1）和10ML2%蛋白