GB 5413.9-2010 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定

中华人民共和国国家标准

GB5413.9—2010

食品安全国家标准

ADE

婴幼儿食品和乳品中维生素、、的

测定

Nationalfoodsafetystandard

DeterminationofvitaminA,D,Einfoodsforinfantsandyoungchildren,

milkandmilkproducts

2010-03-26发布2010-06-01实施

中华人民共和国卫生部发布

GB5413.9—2010

前言

本标准代替GB/T5413.9-1997《婴幼儿配方食品和乳粉维生素A、D、E的测定》。

本标准与GB/T5413.9-1997相比，主要变化如下：

——抗氧化剂由原来的焦性没食子酸改为抗坏血酸；

——将处理方法中的加热回流改为恒温皂化操作；

——增加了标准溶液的校正；

——将原有的单点定量改为标准曲线法；

——增加了维生素D回收率的测定；

——将计算公式进行修改。

本标准附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。

本标准所代替标准的历次版本发布情况为：

——GB5413-1985、GB/T5413.9-1997。

I

GB5413.9—2010

食品安全国家标准

婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定

1范围

本标准规定了婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定方法。

本标准适用于婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定。

2规范性引用文件

本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本

适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。

3原理

试样皂化后，经石油醚萃取，维生素A、E用反相色谱法分离，外标法定量；维生素D用正相色谱

法净化后，反相色谱法分离，外标法定量。

4试剂和材料

除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T6682规定的一级水。

4.1α-淀粉酶：酶活力≥1.5U/mg。

4.2无水硫酸钠。

4.3异丙醇：色谱纯。

4.4乙醇：色谱纯。

4.5氢氧化钾水溶液：称取固体氢氧化钾250g，加入200mL水溶解。

4.6石油醚：沸程30℃～60℃。

4.7甲醇：色谱纯。

4.8正己烷：色谱纯。

4.9环己烷：色谱纯。

4.10维生素C的乙醇溶液（15g/L）。

4.11维生素A、D、E标准溶液

4.11.1维生素A标准储备液（视黄醇）（100μg/mL）：精确称取10mg的维生素A标准品，用乙醇

4.4）溶解并定容于100mL棕色容量瓶中。

（

1

GB5413.9—2010

4.11.2维生素E标准储备液（α-生育酚）（500μg/mL）：精确称取50mg的维生素E标准品，用乙

醇（4.4）溶解并定容于100mL棕色容量瓶中。

4.11.3维生素D2标准储备液（100μg/mL）：精确称取10mg的维生素D2标准品，用乙醇（4.4）溶

解并定容于100mL棕色容量瓶中。

4.11.4维生素D3标准储备液（100μg/mL）：精确称取10mg的维生素D3标准品，用乙醇（4.4）溶

解并定容于100mL棕色容量瓶中。

注：维生素A、D、E标准储备液均须-10℃以下避光储存。标准工作液临用前配制。标准储备溶液用前需校正，见附

录A。

5仪器和设备

5.1高效液相色谱仪，带紫外检测器。

5.2旋转蒸发器。

5.3恒温磁力搅拌器：20℃～80℃。

5.4氮吹仪。

5.5离心机：转速≥5000转/分钟。

5.6培养箱：60℃±2℃。

5.7天平：感量为0.1mg。

6分析步骤

6.1试样处理

6.1.1含淀粉的试样

称取混合均匀的固体试样约5g或液体试样约50g（精确到0.1mg）于250mL三角瓶中，加入lgα-

淀粉酶（4.1），固体试样需用约50mL45℃～50℃的水使其溶解，混合均匀后充氮，盖上瓶塞，置于

60℃±2℃培养箱（5.6）内培养30min。

6.1.2不含淀粉的试样

称取混合均匀的固体试样约10g或液体试样约50g（精确到0.1mg）于250mL三角瓶中，固体试样

需用约50mL45℃～50℃水使其溶解，混合均匀。

6.2测定维生素D的试样需要同时做回收率实验。

6.3待测液的制备

6.3.1皂化：于上述处理的试样溶液中加入约100mL维生素C的乙醇溶液（4.10），充分混匀后加

25mL氢氧化钾水溶液（4.5）混匀，放入磁力搅拌棒，充氮排出空气，盖上胶塞。1000mL的烧杯中加

入约300mL的水，将烧杯放在恒温磁力搅拌器（5.3）上，当水温控制在53℃±2℃时，将三角瓶放入

烧杯中，磁力搅拌皂化约45min后，取出立刻冷却到室温。

6.3.2提取：用少量的水将皂化液全部转入500mL分液漏斗中，加入100mL石油醚（4.6），轻轻摇

动，排气后盖好瓶塞，室温下振荡约10min后静置分层，将水相转入另一500mL分液漏斗中，按上述

方法进行第二次萃取。合并醚液，用水洗至近中性。醚液通过无水硫酸钠过滤脱水，滤液收入500mL

2

GB5413.9—2010

圆底烧瓶中，于旋转蒸发器上在40℃±2℃充氮条件下蒸至近干（绝不允许蒸干）。残渣用石油醚转移

至10mL容量瓶中，定容。

6.3.3从上述容量瓶中准确移取2.0mL石油醚溶液放入试管A中，再准确移取7.0mL石油醚溶液放

入另一试管B中，将试管置于40℃±2℃的氮吹仪（5.4）中，将试管A和B中的石油醚吹干。向试管

A中加5.0mL甲醇（4.7），振荡溶解残渣。向试管B中加2.0mL正己烷（4.8），振荡溶解残渣。再

将试管A和试管B以不低于5000转/分钟的速度离心10min，取出静置至室温后待测。A管用来测定

维生素A、E，B管用来测定维生素D。

6.4测定

6.4.1维生素A、E的测定

6.4.1.1色谱参考条件

色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm，5μm，或具同等性能的色谱柱。

流动相：甲醇（4.7）。

流速：1.0mL/min。

检测波长：维生素A：325nm；维生素E：294nm。

柱温：35℃±1℃。

进样量：20μL。

6.4.1.2维生素A、E标准曲线的绘制

分别准确吸取维生素A标准储备液（4.11.1）0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL于

50mL棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为1.00μg/mL、2.00μg/mL、

3.00μg/mL、4.00μg/mL、5.00μg/mL。

分别准确吸取维生素E标准储备液（4.11.2）1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL于

50mL棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为10.0μg/mL、20.0μg/mL、

30.0μg/mL、40.0μg/mL、50.0μg/mL。

分别将维生素A、E标准工作液注入液相色谱仪中（色谱图参见附录B），得到峰高(或峰面积)。

以峰高(或峰面积)为纵坐标，以维生素A、E标准工作液浓度为横坐标分别绘制维生素A、E标准曲线。

6.4.1.3维生素A、E试样的测定

将试液（6.3.3中A管）注入液相色谱仪中，得到峰高(或峰面积)，根据各自标准曲线得到待测溶液

中维生素A、E的浓度。

6.4.2维生素D的测定

6.4.2.1维生素D待测液的净化

6.4.2.1.1色谱参考条件。

色谱柱：硅胶柱，150mm×4.6mm，或具同等性能的色谱柱。

流动相：环己烷（4.9）与正己烷（4.8）按体积比1：1混合，并按体积分数0.8%加入异丙醇（4.3）。

流速：1mL/min。

波长：264nm。

柱温：35℃±1℃。

进样体积：500μL。

6.4.2.1.2取约0.5mL维生素D标准储备液于10mL具塞试管中，在40℃±2℃的氮吹仪（5.4）上吹干。

残渣用5mL正己烷振荡溶解。取该溶液50μL注入液相色谱仪中测定，确定维生素D保留时间。然后将

500μL待测液（6.3.3中B管）注入液相色谱仪中，根据维生素D标准溶液保留时间收集维生素D馏分于试

管C中。将试管C置于40℃±2℃条件下的氮吹仪中吹干，取出准确加入1.0mL甲醇（4.7），残渣振荡溶

解，即为维生素D测定液。

3

GB5413.9—2010

6.4.2.2维生素D测定液的测定

6.4.2.2.1参考色谱条件

色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm，5μm，或具同等性能的色谱柱。

流动相：甲醇（4.7）。

流速：1mL/min。

检测波长：264nm。

柱温：35℃±1℃。

进样量：100μL。

6.4.2.2.2标准曲线的绘制

分别准确吸取维生素D（或D）标准储备液（4.11.3、4.11.4）0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、

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1.00mL于100棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为0.200μg/mL、

0.400μg/mL、0.600μg/mL、0.800μg/mL、1.000μg/mL。

分别将维生素D（或D）标准工作液注入液相色谱仪中，得到峰高（或峰面积)，参见附录B。以

23

峰高(或峰面积)为纵坐标，以维生素D（或D）标准工作液浓度为横坐标分别绘制标准曲线。

23

6.4.2.2.3维生素D试样的测定

吸取维生素D测定液（6.4.2.1中C管）100μL注入液相色谱仪中（色谱图参见附录B），得到峰高（或

峰面积），根据标准曲线得到维生素D测定液中维生素D