GB/T 18090-2008 猪繁殖与呼吸综合征诊断方法

ICS11.220

B41

中华人民共和国国家标准

GB/T18090—2008

代替GB/T18090—2000

猪繁殖与呼吸综合征诊断方法

Diagnosticmethodsofporcinereproductiveandrespiratorysyndrome

2008-12-31发布2009-05-01实施

发布

GB/T18090—2008

—1—

刖

本标准的修订参照了世界动物卫生组织（OIE）编写的《陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、

禽与蜜蜂）》（第五版,2004）0其技术内容与OIE所推荐的基本一致。

本标准代替GB/T18090—2000«猪繁殖和呼吸综合症诊断方法》。

本标准与GB/T18090—2000相比主要变化如下：

——增加了临床诊断；

-免疫过氧化物酶单层试验作连续4倍稀释，结果的判定按照（）IE编写的《陆生动物诊断试验

和疫苗手册（哺乳动物、禽与蜜蜂）》（第五版，2004）的内容作了相应的修改；

——增加了反转录聚合酶链反应试验。

本标准的附录A、附录E是规范性附录，附录C是资料性附录。

本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。

本标准主要起草人:孙颖杰、苏永生、胡传伟、吴斌、李叶、贾赞、肇惠君。

本标准所代替标准的历次版本发布情况为：

——GB/T18090—2000o

T

GB/T18090—2008

猪繁殖与呼吸综合征诊断方法

1范围

本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的诊断方法。

本标准适用于猪繁殖与呼吸综合征的诊断。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有

的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究

是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682—2008,ISO3696：1987,MOD)

3符号和缩略语

下列符号和缩略语适用于本标准。

bp——碱基对；

CPE——致细胞病变作用；

DEPC——焦碳酸二乙酯；

dNTP——脱氧核昔三磷酸；

EB——漠化乙锭；

HRP——辣根过氧化物酶；

IFA——间接免疫荧光试验；

IPMA——免疫过氧化物酶单层试验；

PBS——磷酸盐缓冲盐水；

PRRS——猪繁殖与呼吸综合征；

RNA——核糖核酸；

RT-PCR——反转录-聚合酶链反应；

Tag酶——TaqDNA聚合酶。

4临床诊断

急性感染初期，猪群表现为食欲低下、发热、昏睡和精神不振等症状，个别猪可出现双耳、外阴、腹

部、口部青紫发纟甘，一般持续1周〜3周；发病高峰的主要特征是母猪早产、流产以及木乃伊胎和弱仔增

多;仔猪断奶前死亡率增加，高峰期一般持续8周〜12周；发病末期，母猪繁殖功能逐渐恢复，达到或接

近病前水平。仔猪和育肥猪存在不同程度的呼吸系统症状,痊愈猪一般生长缓慢，体重较轻。若没有继

发感染，除发病仔猪可见间质性肺炎等特征病变外，一般不表现肉眼可见病变。

有以上临床症状者，可以怀疑猪群有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染，确诊需要实验室

检验。

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GB/T18090—2008

5病毒的分离与鉴定

5.1材料准备

5.1.1器材

二氧化碳培养箱、普通冰箱及低温冰箱、倒置生物显微镜、恒温水浴箱、离心机及离心管、96孔细胞

培养板、微量移液器、组织研磨器、孔径0.2的微孔滤器及滤膜。

5.1.2试剂

RPMI1640细胞培养液、MEM细胞培养液、犊牛血清、青霉素（10“IU/mL）与链霉素（104卩g/mL）

溶液、7.5%碳酸氢钠溶液等。

5.1.3细胞

猪原代肺泡巨噬细胞培养物（PAM）.MARC-145OPAM由未感染过PRRS猪群中6周龄〜8周龄

的猪获取，并经批次检验合格，制备和检验方法见附录Ao

5.1.4样品

5.1.4.1采样

无菌采取扁桃体、肺、淋巴结和脾等组织，血清或腹水置低温保存盒内立即送检。不能立即检测者，

应放一20C冰箱中，长期保存应置于一70C冰箱中。

5.1.4.2制备

血清和腹水可直接检测。肺、脾和扁桃体等组织可单独检测，也可混合后检测。各组织剪碎后研磨

成糊状，加入RPMI164O,制成10%的组织悬液，以3000r/min离心15min,吸取上清液，加入青霉素

500IU/mL,链霉素500Mg/mL.庆大霉素500卩g/mL和两性霉素B200Mg/mLo怀疑有细菌污染的

样品，也可用0.2,um微孔滤膜过滤处理。

5.2操作方法

5.2.1制备细胞板

已建立的某些猴肾细胞系不能支持所有分离株特别是欧洲型病毒株的生长，因此病毒分离应首选

PAM细胞，先将PAM细胞用RPMI1640稀释（含犊牛血清5%,青霉素100IU/mL.链霉素100卩g/mL、庆

大霉素50卩g/mL、两性霉素B10Mg/mL,pH7.2）,稀释细胞终浓度为每毫升1X10"个细胞。或将

MARC-145用MEM稀释，使细胞终浓度为每毫升5X104个细胞。然后，每孔100卩L加入到96孔细

胞培养板中。

5.2.2稀释样品

在空白96孔细胞培养板中加入细胞培养液RPMI1640,每孔90#L,在A排和E排各孔内分别加

入样品，每孔10卩L（样品1：10稀释），将板轻轻摇动后，从A排和E排孔各取10mL分别移入B排和

F排孔内（样品1:100稀释）。将板轻轻摇动后，从B排和F排孔各取10分别移入C排和G排孔

内（样品1:1000稀释），将板轻轻摇动后，从C排和G排孔各取10卩L分别移入D排和排孔内（样

品1：10000稀释）。每个培养板应设置空白对照。振动稀释板后加盖，置4€冰箱内保存备用。

5.2.3接种样品

分别吸取上述稀释样品50卩L接种于5.2.1中对应的细胞孔（第一代）中，放入37€、5%二氧化

碳培养箱中培养，每天观察CPE,连续观察2d~5do

5.2.4培养物盲传

一般在第一代培养2d后，不论有无细胞病变，一律将每孔内细胞液取25卩L,整板移入按照5.2.1

方法制备的新细胞板对应的孔内。放入37°C、5%二氧化碳培养箱中培养2d〜5d,每天观察CPE。

5.3结果判定

通常在接种1d〜2d后可出现CPE,主要呈现细胞圆缩、聚集、固缩，最后溶解脱落。初次接种样

品和盲传后都岀现CPE,或盲传后出现CPE均认为阳性。仅仅初次接种样品出现CPE,认为是由于病

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GB/T18090—2008

料毒性引起的假阳性。

在细胞培养物盲传结束后，不论是否出现CPE,对所有的孔应采用免疫过氧化物酶单层试验

(IPMA)或间接免疫荧光试验(IFA)进行终判；只要对PRRSV标准阳性血清呈现阳性反应，则被认定

为PRRSV分离阳性。

6免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)

6.1材料准备

6.1.1器材

微量移液器、倒置显微镜等。

6.1.2试剂

6.1.2.1IPMA诊断板的制备：见第A.6章。

6.1.2.2标准阳性血清、标准阴性血清和兔抗猪IgGHRP结合物使用前按说明书规定用血清稀释液

稀释至工作浓度。

6.1.2.3洗涤液、血清稀释液和显色/底物溶液按照附录B配制。

6.1.3样品

采集被检猪血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4C或一20C

冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号。

6.2操作方法

6.2.1稀释血清样品：在空板的A排和E排各孔分别加入180(«L的血清稀释液，其余各孔加120皿

将20mL被检血清和对照血清分别加入A排和E排各孔，缓慢摇动，从A排和E排各孔内取40卩L分

别加入B排和F排,依次作1:40J:160.1:640稀释。

6.2.2取上述板中稀释血清样品各50卩L加入IPMA诊断板的相应孔内，封板,37€孵育1h,弃去液

体，用0.15mol/mL氯化钠(NaCl)+O.5%叶温-80洗板三次，

6.2.3用0.15mol/LNaCl和0.5%吐温-80稀释兔抗猪IgGHRP结合物至工作浓度，加入50卩L结

合物稀释液于板中，封板后37C孵育1h,洗涤三次。

6.2.4各孔中加入显色剂/底物(AEC)溶液50卩L,在18C〜22°C室温下作用至少30min,弃去液

体，加入50mL0.05mol/L乙酸钠溶液。

6.3结果判定

将IPMA诊断板置于倒置显微镜下判读。在对照样品成立的前提下，被检血清标本板内各孔约

30%〜50%的细胞质呈现深红色，判读为免疫过氧化物酶单层试验阳性，记作IPMA(+)；细胞质未被

染色，判读为免疫过氧化物酶单层试验阴性，记作IPMA(-)0血清非特异性反应使整孔细胞染色(与

阳性对照比较)。血清滴度以50%以上的孔染色的最高稀释度的倒数表示。血清滴度＜10为阴性，

10或40为弱阳性，非特异性染色常在此范围内，血清滴度$160为阳性。

7间接免疫荧光试验(IFA)

7.1材料准备

7.1.1器材

荧光显微镜、二氧化碳培养箱、恒温箱、保湿盒、微量移液器等。

7.1.2试剂

7.1.2.1IFA诊断板的制备：见第A.7章。

7.1.2.2兔抗猪IgG异硫氧酸荧光素(FITC)结合物、标准阳性血清和标准阴性血清。

7.1.3样品

被检血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，试验前用PBS作20倍稀释。

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GB/T18090—2008

7.2操作方法

7.2.1在96孔板中每孔加入PBS190卩L,再分别加入待检血清、阳性血清、阴性血清10ML（1:20稀

释）。

7.2.296孔板IFA操作步骤

7.2.2.1取96孔IFA诊断板，加入150卩LPBS,室温浸润5min,弃去板中液体，并在吸水纸上轻轻拍

干。

7.2.2.2在96孔IFA诊断板的感染和非感染细胞孔内分别加入50卩L7.2.1中稀释的血清，封板后，

湿盒中37C作用30min,弃去板中血清，在吸水纸上轻轻拍干。每孔加入PBS200pL,洗板六次，弃去

液体。

7.2.2.3每孔加入工作浓度的兔抗猪IgGFITC结合物50卩L,在37C湿盒中作用30mino

7.2.2.4弃去板中结合物，用PBS洗涤四次后，最后在吸水纸上轻轻拍干。用荧光显微镜观察。

7.3结果判定

在对照血清成立的前提下进行，即标准阳性血清对照中感染细胞孔应出现典型的特异性荧光，而未

感染细胞孔不出现荧光;标准阴性血清对照感染细胞孔和未感染细胞孔均不出现荧光。被检血清中未

感染细胞孔不出现荧光，感染细胞孔出现绿色荧光，判为阳性；未感染细胞和感染细胞中都没有特异性

绿色荧光，判为阴性。任何血清在1:20稀释条件下出现可疑结果时应重新检测，或2周〜3周后重新

采样进行检测，重复检测仍为可疑，判为阳性。

8间接酶联免