YY/T 0878.2-2015 医疗器械补体激活试验 第2部分：血清旁路途径补体激活

ICS11.040.01

C30

中华人民共和国医药行业标准

/—

YYT0878.22015

医疗器械补体激活试验

:

第部分血清旁路途径补体激活

2

ㅤㅤㅤㅤ

—

Testforcomlementactivationofmedicaldevices

p

:

Part2Serumalternativeathwacomlementactivation

pyp

2015-03-02发布2016-01-01实施

国家食品药品监督管理总局发布

/—

YYT0878.22015

引言

/。

GBT16886.4中给出了医疗器械或材料血液相容性试验的选择策略本部分是体外旁路途径补

,/。

体激活作用的具体试验方法可作为GBT16886.4中医疗器械或材料补体激活试验的补充

/,。

YYT0878.1为固体材料全补体激活试验提供了指南但是没有区分经典途径和旁路途径本部

,

分为血液接触固体医疗器械或材料旁路途径补体激活的特异性试验可用来筛选固体医疗器械或材料

潜在的补体激活作用。

ㅤㅤㅤㅤ

Ⅱ

/—

YYT0878.22015

医疗器械补体激活试验

:

第部分血清旁路途径补体激活

2

1范围

/的本部分给出了医疗器械体外旁路途径补体激活作用的试验方法。

YYT0878

本部分适用于固态样品。

,“”“”,。

本部分中血清和补体可通用意指将血清用作补体来源

、。

本部分未涉及单一补体成分的功能修饰或消耗以及来源于血浆的补体

:,。

注非固态样品在使用本方法时宜确定方法的适用性

2规范性引用文件

。,

下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文

。,()。

件凡是不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于本文件

/:

医疗器械生物学评价第部分风险管理过程中的评价与试验

GBT16886.11

/:

医疗器械生物学评价第部分与血液相互作用试验选择

GBT16886.44

/:

医疗器械补体激活试验第部分血清全补体激活

YYT0878.11

ㅤㅤㅤㅤ

3术语和定义

/、/界定的术语和定义适用于本文件。

GBT16886.1GBT16886.4

4符号和缩略语

下列符号和缩略语适用于本文件。

:()(,)

Ab抗体溶血素Antibodhemolsin

yy

:()

BBS巴比妥缓冲盐Barbitalbufferedsaline

:()

巴比妥缓冲盐凝胶

BBS-G-Barbitalbufferedsaline-elatin

g

/():2+()(

巴比妥缓冲盐含和凝胶镁缓冲液

BBS-G-EGTAMMBuffer-EGTAMBarbitalbuff-

ggg

eredsaline-elatinEGTAM2+)

gg

():()(

巴比妥缓冲盐金属盐凝胶钙缓冲液

BBS-GMCaBuer-Barbitalbufferedsaline-elatinmet-

ffg

)

als

’:()

C补体Comlement

p

():()

无活性的豚鼠血清

C4-C4GPSC4-deficientuineaiserum

gpg

:()。

注如从遗传学不能产生补体的第组分的豚鼠获得的血清

C44

:,:(,:

EDTA乙二胺四乙酸二钠盐二水合物Ethlenediaminetetraaceticaciddisodiumsaltdi-

y

)

hdrate

y

:,[(),,,

EGTA乙二醇双氨乙基醚四乙酸四钠盐NNN8

Ethlenelco-bisb-aminoethlether-

ygyy

,]

N8-tetraaceticacidtetrasodiumsalt

1

/—

YYT0878.22015

:()

HAGG热凝集丙种球蛋白Heatareatedammalobulin

ggggg

:()

HS人血清Humanserum

:,(,)

I不加材料的含血清对照试管冰上保存Controltubewithserumbutnomaterialketonice

p

:()

M加试验材料的含血清试管Tubecontaininserumlusatestmaterial

gp

:()

NM不加材料的含血清试管Tubecontaininserumbutnomaterial

g

:()

PVDF聚偏二氟乙烯Polvinlidenefluoride

yy

:[()]

RBC红细胞Redbloodcells

5绵羊和兔RBC的制备

(’)。

5.1去纤维蛋白兔RBC和保存在奥尔塞氏Alsevers溶液中的绵羊RBC均在4℃条件下储存绵

,()(

羊在保存周后或第次洗涤上清中含有肉眼可见血色素红色时需丢弃因为大多数寿

RBC82RBC

,,)。,

命的原因它们会对补体裂解更敏感同时自然裂解也增加兔RBC比绵羊RBC更易碎应在保存

,()。

周后或第次洗涤上清中含有肉眼可见血色素红色时丢弃

42

:。,,

注所有的离心应在4℃条件下进行除了另有说明所有试剂试管和细胞制剂都需置于碎冰或冰浴中保持冰冷

状态。

,。

在条件下将绵羊或兔在下离心

5.24℃5mLRBC1000g10min

将细胞沉淀悬浮于冷中,孵育。离心并使细胞沉淀重新悬浮于

5.310mLBBS-G-EDTA37℃10min

的中。

10mL4℃BBS-G-EDTA

,(),()

离心细胞丢弃上清洗第次细胞沉淀重悬于冰冷的中钙缓冲液或

5.4110mLBBS-GM

/()(;

镁缓冲液中用于吸收血清的细胞用钙缓冲液清洗用于步骤检测旁路途径补

ㅤㅤㅤㅤ

BBS-G-EDTAMgB

,)。()。

体消耗的细胞用镁缓冲液清洗和悬浮重复次总共洗次

23

8

(/,、光程为

5.5用分光光度计法对细胞数量进行调节当浓度为2.0×10RBCmL波长为412nm

,/,

1.0cm时体积清洗后的压积加入体积或绵羊RBC吸光度为

1RBC24BBS-GMBBS-G-EGTAMg

,)。、/

兔的吸光度为或用血球计数仪计数制备下或

0.75RBC1.3010mL4℃BBS-GMBBS-G-EGTA

中浓度为8细胞/的细胞悬液。

Mg2.0×10mL

、,。

5.6经过清洗稀释的RBC冰上放置至少可使用12h

()

6血清补体的吸收

,。

6.1虽然在血液接触医疗器械材料旁路途径补体激活时人血清优于豚鼠血清但有遗传缺陷的人血

。:

清却不易获得用抗体柱吸附法消耗补体成分的人血清不适用于该试验原因有以下两个

),;

a特异性成分去除不完全因此还会存在经典途径激活和

),。[()]

柱材料可激活旁路途径降低功能性活性遗传缺陷豚鼠来源的血清没有经

bC4C4-GPS

典途径补体活性但完全能胜任旁路途径补体激活。

,(,())

在检测生物材料补体激活作用时虽然滴度不同与人血清相比裂解相同兔RBC所需C4-GPS

)[],()(2

的浓度较大但可与人血清具有相近的生物补体激活效果见表中琼脂糖凝胶举

5C4-GPS1

)。,()

例因此C4-GPS适合作为检测人类全血中旁路途径激活的补体成分以及裂解产物的确定性免疫

。(),。

测定的筛选试验C4-GPS适用于从生物公司购买的补体源通常标记为试剂级补体

6.2可用绵羊RBC和兔RBC吸收血清以清除自发产生的抗绵羊RBC和抗兔RBC溶血性抗体。

将购买的()储存于。

6.2.1C4-GPS-70℃

()。

6.2.2将血清在碎冰上解冻或用冰水如为冻干剂复溶

2

/—

YYT0878.22015

表镁缓冲液中的兔在人血清中或()中

1RBCC4-GPS

在37℃条件下与100L的琼脂糖凝胶2CL-4B接触1h的裂解百分率a

μ

琼脂糖凝胶2b

CL-4B

制备液c制备液d()e

HS1HS2C4-GPS

[/()]

HSC4-GPS

/3.3±1.23.4±1.76.5±2.6

5012.5

/14.2±0.611.8±0.821.3±3.3

256.25

/23.6±5.219.6±2.820.1±0.9

12.53.13

/33.2±2.829.4±3.827.3±1.4

6.251.57

/[对照]49.9±0.245.3±4.641.3±0.7

0037℃

/[冰对照]51.4±1.652.9±0.758.4±0.5

00

a

个复管的均值标准偏差。

3±

b所示体积为加入到的人体血清或()的琼脂糖凝胶2的体积。

100LC4-GPSCL-4B

μ

c[()],。

人全血清QuidelNHSC镁缓冲液1∶8稀释

d[()],。

重组冻干人血清SimaS1764镁缓冲液1∶4稀释

g

e

全豚鼠血清,[()],。

C4缺陷SimaC1038镁缓冲液1∶3稀释

g

,。,,

6.2.3所有的操作都在冰浴中进行试剂和细胞也需在4℃放置在4℃条件下1000g离心全部

,。

操作在冰冷条件下进行是非常关键的以避免该阶段补体的激活

/,、

按压积血清的比例将冷血清和钙缓冲液洗涤的以体积混合

6.2.40.1mLRBC2.5mL4℃1∶1

,,,。

的绵羊和兔压积RBC通过缓慢摇晃混合冰上孵育10min4℃条件下1000g离心10min将上清

液小心转移至冰上放置的新器皿中。

ㅤㅤㅤㅤ

6.2.5重复6.2.4的步骤两次。

()(),

吸收的以方便次试验使用储存于冰冷的带盖微型离心管中

6.2.6C4-GPS0.5mL~1.0mL1

。,。

-70℃保存直至使用使用当天在碎冰或冰浴中融解不能重复冻存

7全补体滴定确定最佳血清稀释度

,,

一般每种条件采用一支试管或两支试管如需要对结果进行统计学评价所有条件宜进行个平

7.13

,。。

行检测即每种条件都用支圆底一次性使用玻璃试管各试管预先编号条件包

313mm×100mm

“”、“(,’)”、“[()]”“(

括全部裂解无补体只有无试验有或无溶血素的稀释和无血

RBCCC4-GPSRBC

,,)”。、,

清颜色补体颜色对照用最高浓度的血清所有试剂试管和操作需在4℃条件下进行试管应放置

于冰浴中放置的试管架上。

。;

按准备两组试管一组试管内加入镁缓冲液洗涤的绵羊和稀释血清另一组试管

7.27.3~7.4RBC

内加入镁缓冲液洗涤的兔RBC和稀释血清。

将镁缓冲液洗涤的8/“”,

7.32.0×10细胞mLRBC悬液加入到除无RBC管以外的所有试管中每管加

。,

入0.05mL由于加入的细胞体积相对于试管很小宜仔细将准确体积的细胞悬液加入到每个试管的

。“”。

底部中央无RBC管加入0.05mL4℃的镁缓冲液

,