YC/T 150-2002 烟草种子 转基因的测定

ICS65.160

x85

备案号:10587-2002

中华人民共和国烟草行业标准

YC/T150-2002

烟草种子转基因的测定

Tobaccoseed-Determinationofgeneticallymodifiedorganism

2002一09一12发布2002一12一01实施

国家烟草专卖局发布

657

YC/T150-2002

前言

本标准由全国烟草标准化委员会农业分技术委员会提出。

本标准由全国烟草标准化技术委员会归口。

本标准起草单位:中国烟草东北农业试验站。

本标准主要起草人:焦庆明、郭兆奎、闺新甫、万秀清、于艳华、魏继承。

YC/T150-2002

烟草种子转基因的测定

1范围

本标准规定了烟草种子转基因的测定方法。

本标准适用于烟草种子。

2引用标准

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的

修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是

否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

YC/T149-2002烟草及烟草制品转基因的测定

3术语

应符合YC/T149-2002第2章的规定。

4实验室要求

应符合YC/T149-2002第3章的要求。

5试剂

应符合YC/T149-2002第4章的要求。

6仪器与耗材

应符合YC/T149-2002第5章的要求。

7样品的取样方法

以品种为单位，即每个品种作为一个样品，对虽为同一品种，但种子产地或种子生产年份不同，也作

为单一样品取样，每一样品随机多点取样10g，样品编号注明品种名称、种子产地和生产年份。

8DNA提取

8.1前处理

随机取烟草种子。.5g放人装有滤纸保湿的培养皿中，28℃光照下培养5d，种子萌发出苗后，用滤

纸吸出表面水分。

8.2DNA提取

8.2.1种子萌发后提取

8.2.1.1种子萌发幼苗称量约300mg，在灭菌的研钵内加液氮研磨呈粉末，装人1.5ml，离心管中。

8.2.1.2取300mg液氮研磨后的粉末，加入200pl.2XCTAB提取缓冲液，充分混匀后，65C水浴

10min,

82.1.3加人等体积的三氯甲烷:异戊醇(24e1)，混合均匀12000r/min离心4min.

YC/T150-2002

8.2.1.4取上清液，加1/1。体积的10%CTAB提取缓冲液，加人等体积的三抓甲烷:异戊醇

(24:1),混合均匀后12000g离心4min,

8.2.1.5取上清，加等体积的CTAB沉淀缓冲液，混匀15000r/min离心8min,

8.2.1.6去上清，沉淀加100uL高盐TE缓冲液，65℃水浴10min,

8.2.1.7加人二倍体积冷无水乙醇，于一40C下30min,

8.2.18isooog离心8min，沉淀溶于70IA-超纯水中。

8.2.2种子未经萌发直接提取

8.2.2.1将烟草种子浸泡于无菌水中过夜或放人65'C水中1h，取100mg膨涨的种子放人2mL离心

管中捣碎，加人50o讨.1XCTAB抽提缓冲液，剧烈振荡混合均匀后放人65C的恒温水浴中30min。再

12000g离心10min.

8.2-2.2取上清液，加200,1L三氯甲烷混合均匀，12000r/min离心10min,

8.2-2.3取上清液，加2倍体积的CTAB沉淀缓冲液，室温下1h,12000g离心5min,

8.2.2.4去上清液，沉淀加人350川高盐TE缓冲液，加350川三抓甲烷混合30s，离心10min.

8.2.2.5取上清液，加0.6倍体积异戊醇12000r/min离心10min,

8.2-2.6去上清液，沉淀加人500pL乙醇轻微振荡并混合均匀，15000r/min离心10min，沉淀溶于

501,1超纯水中。

8.3DNA含f和纯度的测定

应符合YC/T149--2002第7.3条的规定。

9PCR检测

应符合YC/T149-2002第8章的规定。

JI0烟草种子的卡那，寮抗性法测定

月.压Jl

1把每份种子样品分别放人1.5mL的离心管中。

..司0.nJ

走管内加1.0ml,70%的无水乙醇，然后立即用灭菌的移液器将无水乙醇吸出。

月..压J﹃管内加人1.0mL次氯酸钠，保持30min，期间正反混合均匀几次，然后将液体用移液器吸出。

dl0.刀

月用灭菌水清洗四次。

月.压‘

.J取一个1MI，的枪头，将枪头剪开，使种子能从离心管中吸出，移到1/2MS培养基上光照培养。

月.压亡

.U将萌发的种子转移到分别含有质量分数为。pg/g,50pg/g,100pg/g卡那霉素的1/2MS培养基

上生长，14d以后，以同品种的转基因阳性和阴性材料为对照，观察待测样品种子萌发及其生长情况，

质量分数为100pg/g卡那霉素培养中烟苗颜色变黄，即为非转基因烟草;颜色仍为绿色，是转基因烟草

材料。