SB/T 10463-2008 猪肺炎支原体检验方法

ICS11．220

B41

备案号：24730--2008S日

中华人民共禾口国国内贸易行业标准

10463--2008

SB／T

猪肺炎支原体检验方法

Methodsforthedetectionofofswine

mycoplasmalpneumonia

2008-07-03发布

中华人民共和国商务部发布

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SB／T0463--2008

刖再

本标准的附录A为规范性附录。

本标准由中华人民共和国商务部提出并归口。

本标准由中华人民共和国商务部屠宰技术鉴定中心负责起草。

本标准主要起草人：赵志云、金社胜、郑志明。

10463--2008

SB／T

猪肺炎支原体检验方法

1范围

本标准规定了猪支原体肺炎的检验方法。

本标准适用于生猪屠宰过程中猪支原体肺炎的实验室检验。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有

的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究

是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注El期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

4789．28

GB／T2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3．1

ofswine

猪支原体肺炎mycoplasmalpneumonia

由猪肺炎支原体(3／lycoplasma

患猪长期生长缓慢发育不良、肺门淋巴结呈髓样肿胀，淋巴组织显著增生为特征。

4设备和材料

4．1过滤器：300nm孔径。

4．2剪刀、镊子。

000

4．3锥形瓶：1mL。

4．4均质器或灭菌乳钵。

mL刻度)、5mL(具0．1mL刻度)。

4．5注射器：1mL(具0．1

mL。

4．6量筒：250

miD．。

4．7平皿：直径90

mmXl60

4．8试管：16mm。

4．9吸管：10mL(具0．1mL刻度)。

4．10滤纸、漏斗、纱布、棉花、玻璃棒、胶塞。

注：以上试验器材，在试验前应灭菌处理。

4．11生化培养箱：36℃士1℃。

4．12恒温水浴箱。

4．13高压灭菌器。

4．14厌氧罐：(厌氧培养箱)。

4．15载玻片。

4。16酒精灯。

4．17电子天平：感量0．1g。

4．18光学显微镜：物镜10×～100×。

4．19pH试纸、接种环等。

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5培养基和试剂

5．1姬姆萨氏染色液(见附录A)。

5．2瑞氏染色按GB／T4789．28—2003中2．6的方法进行。

5．3伊红美蓝染色(见附录A)。

5．4Goodwin氏等复合液体培养基(见附录A)。

5．5Goodwin氏等复合固体培养基(见附录A)。

5．6Hank’S液(见附录A)。

6检验程序

图1猪肺炎支原体检验程序

7检验用病料

肺脏、肺门淋巴结。

8检验步骤

8．1病理学检查

8．1．1肉眼检查

肺的病变部位主要见于心叶、尖叶、中间叶及膈叶的前缘。常呈间质性肺炎病变，两侧肺病变大致

对称。病变部界限明显，质地坚实，呈胶样浸润半透明状态。切面湿润、平滑，像嫩肉样(即“肉变”)。严

重的病例病变部颜色加深，呈淡紫红色、深紫色或灰白色、灰红色，至后期半透明状态减轻，坚韧度增加，

似胰脏组织(即“胰变”)。

肺门和纵膈淋巴结肿大，呈灰白色、水肿。切面湿润稍外翻，边缘有时可见轻度充血。

8．1．2触片及染色

min～5

检验样品制成触片，自然干燥，用甲醇固定2min，再以pH7．2的磷酸盐缓冲液稀释20倍

的姬姆萨氏染色液染色3h，水洗后立即用丙酮浸染一次，然后镜检。

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8．1．3镜检

猪肺炎支原体呈紫红色，多数在细胞外，偶见在嗜中性白细胞的胞浆内。呈球状、环状、椭圆形或两

极形、直杆或弯杆状，单个或群集。

8．2分离培养

8．2．1分离

mL

将病肺组织用Hank’s液洗去血液和组织碎片，取病肺25g加入到225Goodwin等氏复合液

000000

体培养基中，用均质器8r／min～10r／rain均质1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎。用灭菌过滤器

过滤，去除杂质。

8．2．2培养

mL

移取10mL滤液转种于i00Goodwin等氏复合液体培养基中，置厌氧罐(或厌氧培养箱)中

d～7

37℃士1℃、含5％～10％CO。条件下，培养3d，观察其产酸和浊度情况，培养基由红变黄，呈轻

微混浊。

取培养液划线接种于Goodwin等氏固体培养基平板，置厌氧罐(或厌氧培养箱)中37℃士1℃，培

d～10

养，在固体培养基上生长缓慢，接种培养7d，观察可见圆形隆起，边缘整齐，表面粗糙，中央有颗

粒的针尖大小或露珠状小菌落。

8．2．3染色

8．2．3．1取液体培养物涂片，自然干燥后火焰固定，姬姆萨氏染色。

8．2．3．2取固体培养物涂片，自然干燥后火焰固定，姬姆萨氏染色。

8．2．4镜检

8．2．5结果判定

镜下所见：因本菌无细胞壁，为多形态微生物，有环状、丝状、点状、杆状和两极状等。液体培养物涂

片，菌体为蓝色、两极浓染的短杆状或逗点状，轮廓清晰。固体培养物涂片，菌体为多形性、环状等等，即

可判定为猪肺炎支原体菌体。

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附录A

(规范性附录)

试剂和培养基

A．1姬姆萨染色液

A．1．1成分

姬姆萨0．6g

甘油50mL

甲醇50mL

A．1．2制法

h～2mL，静置

姬姆萨染料0．6g加于甘油50mL中，55℃--60℃水浴加热1．5h后，加甲醇60

1d以上，过滤成姬姆萨染色原液，临染色前每毫升中性蒸馏水加原液一滴，即成姬姆萨染色液。

A．2美蓝伊红染色液

A．2．1成分

萋竺水7．5“Ll混合溶液

芙蓝1gj

蓍蓑娄钾；?嚣陋溶液

A．2．2制法

美蓝水溶液和高锰酸钾水溶液混合后，55℃～60℃水浴30min，过滤。

A．30．5％伊红酒精液

A．3．1成分

伊红0．5g

无水乙醇100mL

A．3．2制法

将0．5g伊红置玛瑙乳钵中，边研磨边徐徐加入无水乙醇，使伊红完全溶解于无水乙醇中。

A．4Goodwin等氏复合液体培养基

A．4．1成分

Hartley氏消化汤(a)300mL

无菌灭活猪血清(b)200mL

灭活0．5％水解乳蛋白Hank’s液(c)500mL

灭活酵母浸液(d)5mL

20

青霉素000单位

醋酸铊0．125g／1000mL

A．4．2制法

A．4．2．1Hartley氏消化汤

00010000000

牛心750g用均质器8r／minr／rain均质1rain，加蒸馏水1mL，水浴加热至

250

80℃时，加入0．8％无水碳酸氢钠1mL，冷却至45℃加入胰提取液25mL，(新鲜猪胰脏去脂肪切

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碎，250g加蒸馏水750mL加无水乙醇250mL置室温中，常加摇动，第三天用滤纸过滤)三氯甲烷

25mL。

63h，然后加入浓盐酸20mL，水浴蒸汽加热

将上述混合物，置于恒温箱中37℃h或45℃

1

瓶121℃15min高压灭菌，备用。

A．4．2．2猪血清配制方法

猪血清水浴56℃30rain灭活。

A．4．2．30．5％水解乳蛋白Hank’s液配制方法

a)成分

水解乳蛋白2．5g

Hank’s液500mL

混合上述成分，溶解后115℃10min高压灭菌。

b)Hank’s液配制

1)原液一(1)

NaCl160

g

MgS04·7H202g

KCl8

g

MgCl2·6HzO2g

按顺序加入到800mL双蒸馏水中。

2)原液一(2)

CaCI：2．8mL双蒸馏水中。

g溶于100

000

以上两液混合，加双蒸馏水达lmL，加2mL三氯甲烷，保存于5℃冰箱中。

3)原液二(1)

3．04

NazHP04·12H20g

葡萄糖20g

1．20

KH2P04g

按顺序加入到800mL双蒸馏水中。

4)原液二(2)

mol／L的氢

0．4％酚红液100mL(0．4酚红液将0．4g酚红置乳钵中，边研磨边徐徐an．z．0．1

mL量杯中，最后加蒸馏水达100mL)。

氧化钠11．28mL，酚红应完全溶解，置100

000

将酚红液与葡萄糖等混合液混合，加双蒸水至1mL，加入2mL三氯甲烷，保存于5℃

备用。

5)按下方配成Hank’s(汉克斯氏)液

原液一1份

原液二1份

双蒸馏水18份

混合上述成分，4．08妇10rain灭菌，此液在5℃下可保存一个月。用前以1．4％碳酸氢钠

10mL的Hank’s(汉克斯

(4．08kgmin灭菌)，无菌操作，矫正pH到7．4(根据需要而定)，大约每20

氏)液加o．5mL的碳酸氢钠可达pH到7．4。

A．4．2．4酵母浸液

12l℃15

min高压灭菌。

A．4．2．5青霉素

20000单位。

5

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A．4．2．6醋酸铊

0．125000

g／1mL。

A．4．2．73．5％NaHC03溶液

121℃30rain灭菌。

A．5固体培养基

制法：将纯净琼脂按2％溶于水解乳蛋白Hank’s液中高压灭菌，除青霉素外，其他各成分预先放在

56℃中，待琼脂冷却至56℃左右将各成分混合，倾注平板。