DB34/T 2167-2014 油菜黑胫病菌鉴定方法

ICS65.020

B30

DB34

安徽省地方标准

DB34/T2167—2014

油菜黑胫病菌鉴定方法

DetectionandidentificationofLeptosphaeriabiglobosa(Desm.)Ces.etDeNot.

文稿版次选择

2014-09-23发布2014-10-23实施

安徽省质量技术监督局发布

DB34/T2167—2014

前言

本标准依据GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由安徽省农业科学院作物研究所提出并起草。

本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。

本标准主要起草人：荣松柏、李强生、胡宝成、江莹芬、陈凤祥、吴新杰、费维新、侯树敏、范志

雄、雷伟侠、郝仲萍。

I

DB34/T2167—2014

油菜黑胫病菌鉴定方法

1范围

本标准规定了油菜黑胫病菌的现场和室内鉴定的依据和检测方法。

本标准适用于油菜黑胫病菌的鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3鉴定依据

油菜黑胫病菌Leptosphaeriabiglobosa(Desm)Ces.&deNot.属真菌界(Fungi)，子囊菌门

(Ascomycota)，座囊菌纲(Dothideomycetes)，格孢腔菌目(Pleosporales)，格孢腔菌科

(Pleosporaceae)，小球腔菌属(Leptosphaeria)；无性态属茎点霉属Phomalingam。

由Leptosphaeriabiglobosa病菌引起的油菜病害称为油菜黑胫病。

鉴定依据：以油菜黑胫病为害症状、病菌形态学特征、PCR反应和致病性测试结果为鉴定依据。

4主要仪器与用具

生物显微镜、体视显微镜、培养箱、植物生长箱、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、高压灭

菌锅、液氮罐、制冰机、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、冰箱、旋涡振荡器、电子天平（感量0.01g）、

烘箱、培养皿、酒精灯、解剖刀、接种针、移液器、离心管。

5主要试剂与材料

5.1试剂

次氯酸钠，链霉素，氨苄青霉素，商用DNA提取试剂盒或DNA提取试剂：Trisbase，EDTA，NaCl，

SDS，β-巯基乙醇，聚乙烯基吡咯烷酮（PVP），林菲罗琳；PCR试剂：PCRbuffer，Mgcl2，dNTP，Taq

酶；凝胶电泳试剂：琼脂糖，TAE，LoadingBuffer，EB。

5.2培养基

琼脂培养基（Agar），马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA-potatodextroseAgar），马铃薯葡萄糖

肉汤（PDB-potatodextrosebroth）液体培养基，V8果汁琼脂培养基。见附录A。

5.3对照菌株

1

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油菜黑胫病菌（Leptosphaeriabiglobosa(Desm)Ces.&deNot.）菌株；油菜茎基溃疡病菌

(Leptosphaeriamaculans(Desm)Ces.&deNot.)提取的DNA（L.maculans不是必需的）。

6现场检测

植株症状诊断——在油菜生长期进行田间症状目测踏查。

根据油菜黑胫病典型症状进行诊断。

——子叶/叶片症状：黑色坏死斑点（由致病力弱的菌株造成）；或灰白色病斑（由致病力强的菌

株造成），病斑易破裂，有黑色小粒点（为分生孢子器）。（见附录B，图1、2、3）

——茎杆表面症状：早期染病茎秆部位呈灰色，病斑处有黑色的边界。后期茎秆干枯时，病斑呈灰

白色，有时灰白色病斑处有小黑点（分生孢子器）生成。（见附录B，图4、5）

——茎秆横截面症状：感染组织横切面有黑色部分，为茎髓组织溃疡，面积因病菌侵染程度而不同，

严重时染病植株茎基部受侵染形成腐烂。（见附录B，图6、7）

对于田间不能确定的，采集疑似症状的植株样本进行室内检测鉴定。

7实验室检测

7.1病菌的分离纯化

见附录C。

7.2菌落培养特性和病菌形态特征鉴定

病原菌(L.biglobosa)在PDA平板上，菌丝呈黄色绒毛状，菌丝分枝少，菌落规则。

培养一段时间后，气生菌丝上产生黄色（或黄棕色、红棕色）液珠，且菌株间存在色素水平差异。

在衰老菌丝体上可观察到黑色小粒点（为分生孢子器），（见附录D，图1、2、3、4）；分生孢子器球

形至扁球形，深黑褐色，散生、埋生或半埋生于菌丝中。分生孢子为无色透明，椭圆形至纺锤形，内含

2个油球，分生孢子大小3～5.5μm×1.3～2.7μm（见附录D，图5）。子囊壳呈球形，黑色，有孔

口，直径360μm～500μm；子囊棍棒形，内有8个子囊孢子，（见附录D，图6）；子囊孢子长椭圆

形，具5～8个隔膜，黄褐色，大小（30～70