DB45/T 1509-2017 H10N8亚型禽流感病毒反应法

ICS11.220

B4141B

DB45

广西壮族自治区地方标准

DB150945/T—2017

H10N8多重反转录亚型禽流感病毒的检测

聚合酶链反应法聚合酶链反应法

MultiplexRT-PCRfordetectionofH10N8subtypeavianinfluenzavirusvirusinfluenzaaviansubtypeH10N8ofdetectionforRT-PCRMultiplex

2017-04-15发布2017-05-15实施

广西壮族自治区质量技术监督局发布

DB45/T1509DB45/T—2017

目目次

前言................................................................................II................................................................................前言

11..............................................................................范围

21........................................................................术语和定义

32........................................................................材料与试剂

43..........................................................................检测方法

55..........................................................................结果判定

65......................................................................废弃物的处理

附录A（资料性附录）引物序列及检测结果判断图示6......................................

附录B（规范性附录）溶液的配制7......................................................

附录C（规范性附录）标准中化学词汇汉英对照9..........................................

I

DB45/T1509DB45/T—2017

II

DB45/T1509DB45/T—2017

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。1.1—2009给出的规则起草。本标准按照GB/T

本标准由广西壮族自治区水产畜牧兽医局提出并归口。

本标准起草单位：广西壮族自治区兽医研究所。

本标准主要起草人：谢芝勋、罗思思、谢志勤、谢丽基、邓显文、刘加波、范晴、黄莉、黄娇玲、

曾婷婷、王盛、张艳芳。

III

DB45/T1509DB45/T—2017

H10N8亚型禽流感病毒的检测多重反转录聚合酶链反应法

11范围

本标准规定了H10N8亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链反应法检测的术语和定义、材料与试剂、

检测方法、结果判定及废弃物的处理。

本标准适用于H10N8亚型禽流感病毒的检测。本标准适用于H10N8亚型禽流感病毒的检测。

22术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

2.12.1

H10N8virus，AIVinfluenzaaviansubtypeH10N8亚型禽流感病毒

本病毒属于正黏病毒科，A型流感病毒属，基因组为单股负链、分节段的RNA。其血凝素类型为H10，

神经氨酸酶类型为N8。神经氨酸酶类型为N8。

2.22.2

反转录reversetranscription，RTtranscription，RTreverse反转录

以RNA为模板合成cDNA的过程。以RNA为模板合成cDNA的过程。

2.32.3

聚合酶链反应polymerasechainreaction，PCRreaction，PCRchainpolymerase聚合酶链反应

是模板DNA在引物和4种脱氧核糖核酸底物及Mg2+存在的条件下，依赖于TaqDNA聚合酶的酶促反应。

又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术，简称PCR技术。

2.42.4

引物primer，Pprimer，P引物

指分别与待扩增DNA片段两侧互补的一小段(约20bp)寡核苷酸。bp)寡核苷酸。指分别与待扩增DNA片段两侧互补的一小段(约20

2.52.5

特异性引物specificprimer，SPprimer，SPspecific特异性引物

针对特定DNA片段在其两侧设计合成的一小段互补寡核苷酸，在PCR反应中与DNA模板特异性结合。

它决定了PCR扩增产物的特异性。它决定了PCR扩增产物的特异性。

2.62.6

多重RT-PCRreaction，RT-PCRchainpolymerasetranscriptionreverse反应

-是一种特殊RT形式，PCR同一模板的几个区域，通常是指在同一反应体系中加入多对引物，扩增即

一次PCR反应，可同时检测、鉴别出多种病原体。

1

DB45/T1509DB45/T—2017

33材料与试剂

3.13.1试剂

3.1.13.1.1H10N8亚型AIV特异性引物

根据H10N8亚型AIVHA基因和和NA基因序列，分别设计了用于扩增HA和NA基因的两对特异性引物

HA1、HA2和NA1、NA2。引物HA1和HA2扩增HA目的片段大小为267bp，引物NA1和NA2扩增NA目的片段大小

为464为464bp，引物的使用浓度均为25µmol/L。根据附录A中A.1.1给出的引物寡核苷酸序列送测序公司合成。

使用前先用灭菌双蒸水稀释，置－20℃保存备用。

3.1.23.1.2RNA抽提试剂

RNA抽提试剂如下：

——TrizolRNA抽提试剂；

——氯仿；

——异丙醇；

——75℅乙醇（DEPC水配制）。

注：Trizol®RNA抽提试剂（商品名）是由Invitrogen公司（供应商）提供的产品的商品名。给出这一信息是为了

方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其它等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。

3.1.33.1.3RT-PCR试剂盒

RT-PCR试剂盒如下：

——TaqDNA——Taq聚合酶；

——反转录酶；

——RNA酶抑制剂；

——随机引物；

——dNTPs混合物：包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP；

——10倍PCR缓冲液（含Mg2+）。

注：试剂盒包含了RNA反转录以及PCR扩增所必需的各种酶、dNTPs及Mg2+等全部试剂。可向多个生物工程公司购得，

使用时按本标准给出的量使用。

3.1.43.1.4电泳试剂

电泳试剂如下：

——1℅琼脂糖溶液；

——10mg/mLGoldView染料；

——加样缓冲液；

——1倍TAE电泳缓冲液。

3.1.53.1.5其他