GB/T 27538-2011 动物流感检测 A型H1N1流感病毒中HA、NA的焦磷酸测序检测方法

ICS11．220

B41

a雷

中华人民共和国国家标准

GB／T27538--2011

动物流感检测A型H1N1流感病毒中

HA、NA的焦磷酸测序检测方法

Animalinfluenzadetection--MethodofpyrosequencingforHAandNAin

influenzavirusA(H1N1)

2011-11-21发布2012—03—01实施

宰瞀鹳紫瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会“19

前言GB／T27538--2011本标准按照GB／T．1—209给出的规则起草。由中华人民共和国农业部提出。全国动物防疫标准化技术委员会(sAC／TC81)归口。起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。主要起草人：徐彪、梁成珠、凌宗帅、张太翔、岳志芹、高宏伟、孙涛、方绍庆、林祥梅、韩雪清、朱来华、张鹤晓、单虎。

1范围

动物流感检测A型H1N1流感病毒中

HA、NA的焦磷酸测序检测方法

GB／T27538--2011

本标准规定了焦磷酸测序技术用于A型HINl流感病毒及其墨西哥变异株中的HA和NA核酸

序列检测方法。

本标准适用于A型H1N1流感病毒通用及A型H1N1流感病毒墨西哥变异株的核酸检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB／T18088出入境动物检疫采样

GB19489实验室生物安全通用要求

NY／T541动物疫病实验室检验采样方法

SN／T1193基因检验实验室技术要求

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

ATP：三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate)

DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)

DEPC：焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)

PBS：磷酸盐缓冲生理盐水(phosphatebelaneedsolution)

Pyrosequencing：焦磷酸测序

RT-PCR：反转录聚合酶链式反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction)

RNA：核糖核酸(ribonucleieacid)

Taq酶：TaqDNA聚合酶

4原理

焦磷酸测序是通过测序引物和PCR扩增单链DNA模板杂交，与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧

光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶和底物(APs)、荧光素孵育，逐一加人四种dNTPs(dATP，dTTP，dCTP，

dGTP)，如与模板配对，此dNTP与引物的末端形成共价键，释放焦磷酸基团(PPi)；ATP硫酸化酶在

APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素转化，氧化荧

光素发出与ATP量成正比的可见光信号；光信号由电荷耦合检测器(CCD)收集并由软件转化为峰。

每个光信号的峰高与反应中掺人的核苷酸数目成正比。ATP和未掺人的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸

酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。

】

GB／T27538--20115试剂和材料．1除特别说明外，本标准所用试剂为分析纯或生化试剂，所有试剂均用无RNA酶污染的器具(用DEPC水处理)分装，实验用水符合GB／T6682的规定。焦磷酸测序用引物(对)序列见附录A。3AMV反转录酶。4TaqNA聚合酶。PyrooldSqAReagentsDN序列分析试剂盒或其他等效试剂。6NTPs。7琼脂糖(电泳纯)。8三氯甲烷9异丙醇1070％乙醇：配制方法见附录B。分子量标准品(100bp～2000)。2裂解液：Trizol或其他等效总RNA提取试剂。S：配制方法见附录B。41×PCR缓冲液：建议使用厂家提供，如需配制见附录B。5电