DB34/T 2560-2015 窖泥微生物群落结构快速定量测定 PSP-qPCR绝对定量法

ICS01.040.67

X60

DB34

安徽省地方标准

DB34/T2560—2015

窖泥微生物群落结构快速定量测定

PSP-qPCR绝对定量法

QuicklydetectionmethedtoquantifypitsmudmicrobialcommunitiesPSP-absolute

qPCRmethod

文稿版次选择

2015-12-30发布2016-01-30实施

安徽省质量技术监督局发布

DB34/T2560—2015

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由安徽省浓香型白酒标准化技术委员会提出并归口。

本标准起草单位：安徽瑞思威尔科技有限公司、安徽古井贡酒股份有限公司、哈尔滨工业大学。

本标准起草人：何宏魁、周庆伍、李安军、刘国英、余秀娟、汤有宏、葛向阳、张会敏、蒋军、聂

加燕。

I

DB34/T2560—2015

窖泥微生物群落结构快速定量测定PSP-qPCR绝对定量法

1范围

本标准规定了一种基于门特异性引物测定窖泥微生物群落结构组成的快速定量优化方法。

本标准适用于窖泥中微生物群落结构的快速定量检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

门特异性引物phylum-specificprimers，PSP

指特异性扩增某个门的所有微生物基因序列所共有且相对于其余门的微生物基因序列所独有的基

因序列的引物对，由一条正向引物（5’→3’）和一条反向引物（3’→5’)组成。

3.2

荧光定量PCRquantitativePCR，qPCR

又称real-timePCR，荧光反转录-聚合酶链反应。

3.3

Ct值cyclethresholdvalue

指PCR反应体系中目标DNA浓度达到人为确定的阈值时的PCR循环次数。

3.4

TA克隆TAClone

是一种亚克隆方式，在连接酶存在的情况下，依赖DNA链两端的腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）的互

补作用，将不同DNA链连接。

4原理

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实时荧光PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个PCR

过程。将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热

循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体

系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过

实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，进而根据未知样品的Ct值在标准曲线

的位置得到未知样品中目标序列的初始拷贝浓度的方法。

采用SAP技术（单碱基差异原则）设计门特异性引物，在引物的3’端为单核苷酸多态性位点，当

在引物3’末端倒数第二个碱基引入错配后，若最后一个碱基是强配对碱基，则此种情况下引物仍可以

与模板配对并延伸。

5试剂和材料

5.1本标准中所用的水，除文中提到的ddH2O属于经过两次蒸馏的双蒸水以外，其他实验室用水均指

符合GB/T6682中要求的三级水。所述溶液，在未特别注明，均指水溶液。

5.2土壤基因组DNA提取试剂盒。

5.3胶回收试剂盒。

注：胶回收试剂盒是由相关试剂公司提供，可用不同公司的等效产品具有相同效果即可。

5.4TA克隆试剂盒。

注：TA克隆试剂盒是由相关试剂公司提供，可用不同公司的等效产品具有相同效果即可。

5.5大肠杆菌感受态细胞。

注：大肠杆菌感受态细胞是由相关试剂公司提供，可用不同公司的等效产品具有相同效果即可。

5.6PCR试剂盒。

5.7qPCR试剂盒。

5.8质粒DNA提取试剂盒。

5.9细菌16SrDNA扩增引物。

注：第4章中所述主要试剂提及几种试剂盒和试剂，由于不同品牌的试剂盒中试剂和操作步骤略有差异，根据各

种试剂盒实际使用效果，为方便本标准的使用者，现对部分试剂盒给予常用供应商标注，供标准使用者参考。

6仪器和设备

6.1紫外核酸检测仪。

6.2荧光定量PCR仪。

6.3PCR仪。

6.4凝胶成像系统。

6.5高速冷冻离心机。

6.6冰盒。

6.7移液枪。

6.8八连管离心机。

7测定步骤

7.1门特异性引物设计

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DB34/T2560—2015

7.1.1样品总DNA的提取、细菌16SrDNA的PCR扩增、克隆文库的构建及阳性克隆的筛选

提取窖泥样品中的基因组总DNA（按5.2说明书的方法），以此为模板扩增接近全长的16SrDNA。

选择扩增引物1，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，将指定片段的条带切胶回收纯化（按5.3说明书的方法），

然后进行TA克隆（按5.4说明书的方法），连接产物进行转化（按5.5说明书方法），后进行蓝白

斑筛选，获得一定数目的有效克隆2。

注1：扩增引物可以选择27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’），

但不限于此。

注2：有效克隆在这里指最后的双向测序序列经过序列比对确实属于16SrDNA序列。

7.1.2克隆测序、序列分析

有效克隆经过DNA测序，得到双向测序序列，利用拼接软件完成双向序列拼接，去掉来自克隆载

体的多余序列。经过相应网站（见编制说明）的进行比对，确定与已知序列的同源关系。将结果相同的

序列归为一个OTU（Operationaltaxonomicunit）。

可进一步通过将各OUT的未知代表序列和已知标准菌的序列一起建立系统发育树的方式确认彼此

之间的亲缘关系。

把相同的门归在一起，不同的门之间的序列差异通过SAP技术处理3，这些引物对以每个门的实际

16S序列的TA克隆纯质粒为模板进行PCR（按4.5说明书的方法）验证及所有门混合模板验证，以

及qPCR（按5.6说明书的方法）验证，结果要求只扩增出来特异目的条带，Tm值分析只有主带，且

不含引物二聚体或极少二聚体，得到门特异性引物序列4。

注3：所述引物在SAP技术处理过程中，在某些引物的3’端倒数第二碱基引入人为错配，该错配不影响靶序列的扩

增，却可以破坏非靶序列的扩增，增强了引物的特异性。

注4：得到的门特异性引物序列直接通过有关生物技术公司合成。

7.2群落结构定量方法-PSP-qPCR绝对定量法

注：由于不同qPCR定量测定涉及qPCR体系配制和程序设定，而不同qPCR试剂盒和不同qPCR仪在操作上会有

所不同，本标准给出的方法较笼统，具体操作可参考附件C中举例说明。

7.2.1普通PCR引物筛选实验

a)进行梯度PCR，电泳。通过电泳，选择最佳退火温度，将产生引物二聚体的引物排除。

b)选择出来的引物扩增对应门的16SrDNA序列和非对应门的16SrDNA序列。模板选择使用TA

克隆质粒。选择能够正确扩增目标序列的引物（选择引物的原则是所选引物能正确扩增目标序

列，对非目标序列不扩增。若引物对目标序列正常扩增，对非目标序列有微弱的扩增，对此引

物选择保留）。

7.2.2qPCR预实验

经普通PCR试验筛选出的PSP引物进行qPCR预实验5（按5.7说明书的方法）。

检查扩增曲线和溶解曲线。溶解曲线中，只有PCR产物所产生的峰，没有引物二聚体峰存在。同

6

时做空白对照（以ddH2O为模板）和阴性对照（以非目标质粒为模板），确保没有扩增曲线产生，即

一直保持水平线，没有起峰，没有典型的对数生长期。另外，引物二聚体扩增峰典型得出现于空白对照

中，尤其是扩增循环的后面几个循环。即这种情况下，实验样品扩增曲线和溶解曲线正常，空白对照的

溶解曲线只有引物二聚体的峰,阴性对照只有非目标产物峰或者引物二聚体峰。

注5：所述qPCR预实验是指只进行简单的qPCR试验，不需要配合使用标准品制作标准曲线。

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DB34/T2560—2015

注6：如果阴性对照出现了扩增曲线，非目标序列微弱扩增。在qPCR扩增曲线图谱中表现为阴性对照，即非正常扩

增的目标产物的扩增曲线开始起峰的循环数少于正常样品的循环数。少于35个循环，选择保留，检测时，只

要将qPCR检测程序设定为