GB/T 18645-2020 动物结核病诊断技术

ICS11.220

B41GB

中华人民共和国国家标准

GB/T18645-2020

代替GB/T186452002

动物结核病诊断技术

Diagnostictechniquesforanimaltuberculosis

2020-12-14发布2020-12-14实施

国家市场监督管理总局申＃

国家标准化管理委员会保叩

GB/T18645-2020

目次

前言”………·……”………”…·…E

引言”…………·……”…………N

1范围…”………·………1

2规范性引用文件……·……”…·……1

3缩略语…”………·………1

4临床诊断…………”…”1

4.1流行特点……··……”………·……1

4.2临床症状………”………·…….2

4.3病理变化…………”…...........................2

5细菌学检查………………”…2

5.1器材…”…………”………2

5.2试剂…”……··…………·………2

5.3病料的采集、运送与处理……··…………·……2

5.4染色镜检…………”…...........................3

5.5分离培养和生化鉴定………”……….4

6结核菌素皮内变态反应试验………”……·……5

6.1器材…·……·…5

6.2试剂…”……··…………·………5

6.3牛分校杆菌PPD皮内变态反应…··…………·……5

6.4禽分校杆菌PPD皮内变态反应…………”………·……….6

6.5其他动物结核皮内变态反应“…··…………·…...........................6

7PCR检测…“…………”………·……6

7.1器材………6

7.2试剂………··……6

7.3采样及样品处理…………7

7.4PCR扩增反应……”…·……7

7.5电泳检测PCR扩增产物………8

7.6质控“……8

7.7结果分析及判定………..••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••8

7.8PCR检测结果的确证…………·……”…·……8

8γ－干扰素CIFN－γ）体外检测法（体外IFN-1'释放试验检测法）•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••8

8.1器材…”……”………”………….8

8.2试剂……………”…...........................8

8.3操作方法…”….•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••8

9诊断结果判定…··……”…………10

I

GB/T18645-2020

附录A（资料性附录〉试剂的配方……….11

附录B（资料性附录）标本消化浓缩法………·…”……17

附录c（规范性附录）采样及样品处理（PCR检测用）……”……·”…..18

附录D（资料性附录）DNA提取液………”…·…….20

附录E（资料性附录〉常规PCR扩增产物核酸序列………”…·…….21

附录F（规范性附录〉样品采集、包装和运输的要求………”………·……22

Il

GB/T18645-2020

前言

本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。

本标准代替GB/T18645-2002《动物结核病诊断技术》。与GB/T18645-2002相比，主要技术内

容变化如下2

一一增加了引言；

一一增加了规范性引用文件（见第2章）;

增加了缩略语〈见第3章）；

增加了临床诊断方法，包括流行特点、临床症状和病理变化（见4.1、4.2和4.3);

一一增加了警示内容，对于剖检、采样及实验室开展相关病原检测部分及实验室接触有毒物质部分

给以警示（见4.3);

一一增加了其他动物皮内变态反应（见6.5);

一一增加了PCR检测（见第7章）;

增加了＂（－干扰素(IFN－γ）体外检测法（见第8章）;

增加了诊断结果判定（见第9章h

一一删除了动物接种试验的内容（见2002年版的2.3.1);

一一增加了常规PCR扩增产物核酸序列（见附录E);

一一增加了样品采集、包装和运输要求（见附录F）。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本标准由中华人民共和国农业农村部提出。

本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。

本标准起草单位2中国兽医药品监察所、中国动物卫生与流行病学研究中心。

本标准主要起草人g朱良全、丁家波、沈青春、孙明军、毛开荣、魏荣、许冠龙、冯宇。

本标准所代替标准的历次发布版本情况为＝

GB/T186452002o

m

GB/T18645-2020

冒｜言

动物结核病是由分校杆菌属的细菌引起的一种慢性、人兽共患性传染病，在全世界范围内严重威胁

人类健康并影响畜牧业发展。分枝杆菌属主要由结核分枝杆菌复合群、麻风分枝杆菌以及非结核分枝

杆菌所组成。而牛分校杆菌、结核分枝杆菌是结核分枝杆菌复合群的成员，禽分枝杆菌属于非结核分枝

杆菌成员。牛结核病是国家三类动物疫病，也是《国家中长期动物疫病防治规划（20122020年）》中16种

优先防治的国内动物疫病之一，其病原主要为牛分校杆菌。牛分枝杆菌的宿主谱广，几乎包括所有的温

血脊椎动物。除牛最易感外，还可感染鹿、猪等多种动物g结核分校杆菌主要导致人结核病，但也可感染

牛P禽分校杆菌禽亚种主要引起禽结核病。

动物结核病主要通过呼吸道和消化道感染，可侵害多种动物，家畜中奶牛最易感，其次为黄牛、非是

牛、水牛、猪和家禽，野生动物中以鹿较为常见。该病临床上主要特征是病程缓慢、渐进性消瘦、咳嗽、衰

竭，并在多种组织器官（如肺、肝、脾和肠道等）形成肉芽肿和干酶样钙化结节。

近年来国内外对动物结核病防控十分重视，如发病率高、危害较为严重的牛结核病被世界动物卫生

组织（OIE）列为必须通报疫病，也是国际贸易必检对象。随着国际贸易的蓬勃发展，动物结核病可在人

及多种动物间传播，对畜牧业及公共卫生安全危害严重。目前我国采用的动物结核病的诊断技术国家

标准为GB/T186452002《动物结核病诊断技术》，其受当时知识和技术条件所限，内容己不能满足当

前动物结核病诊断、检疫检测需求。主要存在以下突出问题，1）对于人兽共患性动物结核病诊断的国家

标准，缺少必要的生物安全要求，以及流行病学、临床症状和病理变化等临床诊断的相关内容。2）诊断

方法涉及动物接种实验内容，因确诊时间长（至少1个月）和动物福利的因素，国际上现已很少使用。

3）诊断方法缺少新的通用成熟技术（如PCR、体外检测γ干扰素法等）。4）需要对标准中涉及的烟酸试

验或硝基苯甲酸试验的生化方法进行规范统一。如GB/T18645-2002《动物结核病诊断技术》与

SNIT13102011《动物结核病检验检疫技术规范》中涉及生化试验方法不统一．前者采用烟酸试验毒

性较大，而后者采用对硝基苯甲酸试验相对安全。5）需要增加适用范围，以满足出人境检验检疫工作发

展的需要，因此，修订完善适用于我国动物结核病诊断的国家标准，对于临床兽医、检验检疫等科研工

作者及时、准确做好诊断，从而对疫病防控和疫情处置采取快速、舍理有效的应对措施，意义重大。

N

GB/T18645-2020

动物结核病诊断技术

1范围

本标准规定了动物结核病的临床诊断、细菌学检查、皮内变态反应、PCR和γ－干扰素OFN－γ）体外

检测的技术方法、操作程序和判定标准。

本标准适用于动物结核病的诊断，其中流行特点、临床症状、病理变化以及皮内变态反应适用于动

物结核病的临床诊断g细菌学检查中染色镜检适用于动物结核病病原学初步诊断，细菌学检查中分离培

养和生化鉴定、病原分离和PCR试验适用于动物结核病病原学确诊川－干扰素(IFN-'Y）体外检测法适用

于牛结核病的辅助诊断。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T18088出入境动物检疫采样

GB19489实验室生物安全通用要求

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

OIE，世界动物卫生组织（WorldOrganizationforAnimalHealth)

PPD，提纯蛋白衍生物（PurifiedProteinDerivative)

IU，国际单位(InternationalUnit)

PCR，聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction)

ELISA，酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedImmuno-sorbentAssay)

TCH，喔吩2竣酸脐培养基（Thiophen2carboxylicAcidHydrazide)

IFNγz伽马干扰素（GammaInterferon)

PNB，对硝基苯甲酸（PnitrobenzoicAcid)

DNA，脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid)

dNTPs，脱氧核背三磷酸（Deoxy-RibonucleosideTriphosphate)

EDTA，乙三胶四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid]

4临床诊断

4.1流行特点

多种动物对牛分校杆菌、结核分枝杆菌、禽分枝杆菌等易感，动物中奶牛最易感，其次为黄牛、轮牛、

水牛、猪和家禽，野生动物中以鹿较为常见。结核分枝杆菌主要侵害人，少见于牛、猪P牛分枝杆菌主要

侵害牛，亦可感染人、绵羊、山羊、猪及犬g禽分枝杆菌主要侵害家禽和水禽，其中鸡和鸽最易感染，鹅和

鸭次之，牛、猪和人也可感染。实验动物中，豚鼠对牛分枝杆菌和结核分枝杆菌敏感，对禽分枝杆菌有抵

抗力，通常只能形成局部病灶；家兔对禽分枝杆菌高度敏感，对牛分枝杆菌敏感，结核分枝杆菌虽可使家

GB/T18645-2020

兔肺部形成少量病灶，但可趋于痊愈而不致死。

本病主要通过呼吸道和消化道感染，也可通过交配感染．污染的饲草饲料通过消化道感染也是一

个重要的途径。该病可发生在动物的任何年龄，雌性动物感染率高于雄性。

4.2I临床症状

感染通常呈慢性经过，病初症状不明显，当病程逐渐延长，则症状逐渐显露。由于患病器官不同，症

状亦不一致z

a)牛结核病常表现为肺结核、乳房结核、淋巴结核，有时可见肠结核、生殖器结核、脑结核、浆膜结

核及全身性结核。

b)禽结核病常表现贫血、消瘦，鸡冠萎缩以及产蛋停止等。病禽可因衰竭或肝变性破裂而突然

死亡．

c)鹿结核病症状与牛结核病基本相同。

d）猪结核病多表现为淋巴结核，最常发病部位为领下、咽、颈及肠系膜淋巴结P肺、肝、肠、胃等结

核时主要表现消瘦、咳嗽、气喘等症状。肠道有病灶时则可能发生下病。

e)绵羊及山羊结核病常不表现明显的临床症状，往往在屠宰后才被发现，体内淋巴结可见结核

病灶。

4.3病理变化

警示－一对本病f!iJ栓采样过程申应防止病原微生物扩散和感染。相关操作应符合GB/T18088和

GB19489的规定。

根据结核病引起动物机体病理变化的差异，可将其分为增生性和渗出性结核两种，有时两种病灶同

时存在。当机体抵抗力强时，对结核菌的反应常以细胞增生为主，形成增生性结核结节，即由类上反细

胞和巨细胞集结在结核菌周围形成特异性的肉芽肿，外周是一层密集的淋巴细胞和成纤维细胞从而形

成非特异性肉芽组织。当机体抵抗力低时，则以渗出性炎症为主，即在组织中有纤维蛋白和淋巴细胞的

弥漫性沉积，随后发生干酷样坏死、化服或钙化，这种变化主要见于肺和淋巴结。

5细菌学检查

5.1器材

E级生物安全柜、恒温培养箱、冰箱（2℃～8℃，一15℃以下）、离心机（离心力可达2000g）、显

微镜。

5.2试剂

除特别规定外，所用化学试剂均为分析纯。

溶液与培养基，4%硫酸、3%或4%氢氧化销溶液、5%～10%盐酸溶液、氢氧化销消化液、0.1mol/L拧

橡酸铺溶液、安替福民（antiformin〕溶液、甘油蛋白、妻－尼氏（Ziehl-Neelsen）抗酸染色液，对硝基苯甲酸

(PNB）培养基、PBS(1/15mol/L）缓冲液、改良罗氏（Lowenstein-Jensen,L-J)培养基、吐温－80(Tween-

80）水解试验溶液、硝酸盐还原试验溶液、0.12%尿素溶液、0.1%盼红指示剂、喔吩2竣酸脐（TCH）培

养基。配制方法参见附录Ao

5.3病料的采集、运送与处理

5.3.1病料的采集

病料的采集，包括以下内容E

2

GB/T18645-2020

一一对于病、死动物，应采集其淋巴结及病变组织器官（如：肺、肝、脾等〕作为细菌学检查材料，

一一对于怀疑有呼吸道结核、乳房结核、泌尿生殖道结核、肠结核的活畜，应相应采集其痰、乳、精

液、子宫分泌物、尿和粪便作为细菌学检查材料。

对于皮内变态反应试验阳性，但尸检无病理学变化的动物，应采集其下债、咽后、支气管、肺（特

别是肺门淋巴结）、纵隔及一些肠系膜的淋巴结作为细菌学检查材料。

5.3.2病料的运送

样品应封装在无菌的洁净容器或样品袋内冷藏运送。如当天无法送达实验室的，应予冷冻后运送。

当元法提供冷冻条件时，可在病料中加入砌酸，使其终浓度为0.5%，但样品处理保存时间不超过1周。

样品采集、包装和运输详细要求应按附录F的规定执行。

5.3.3病料的处理

5.3.3.1硫酸消化法

此法适用于痰、尿、粪和病变组织等的处理。处理前，病变组织先按常规方法研磨或匀浆制成乳剂。

将痰、尿、粪或病变组织等按1'5（样品z溶液，质量浓度）加人4%硫酸溶液充分混合，然后置37℃作用

1h~2h，经1000g离心30min，弃上清液，取沉淀物涂片镜检、培养g也可用硫酸处理后，在沉淀物中

滴加3%氢氧化销溶液中和，然后涂片镜检或培养。硫酸消化法具体操作参见附录B的B.20

5.3.3.2氢氧化铺消化法

此法适用于痰、尿、粪和病变组织等的处理。消化处理前，病变组织先按常规方法制成乳剂。将被

检的痰、尿、粪便或病变组织按1'5（样品g溶液，质量浓度）的比例加入氢氧化销消化液中，混匀后，

37℃作用2h～3h，然后元菌滴加5%盐酸溶液（参见A.3）进行中和，将样本的pH值调到6.8左右〈此

时显淡黄绿色），以1000g，离心15min~20min，弃上清液，取沉淀物涂片镜检或培养。

对痰液的消化浓缩还可采用以下处理方法2取4%氢氧化销溶液50mL、0.1mol/L拧橡酸销

50mL、N－乙酷－L－半胧氨酸0.5g混合。将上述混合液与痰液按1'2的比例加入，作用24h~48h，以

1000g离心15min，取沉淀物涂片镜检或培养。氢氧化锅消化法具体操作参见B.3"

5.3.3.3安替福民（antiformin）沉淀浓缩法

此法适用于痰、乳、精液和子宫分泌液等处理。将被检样品置于试管中，加人3倍～4倍量的15%～

20%安替福民溶液，充分摇匀后37℃作用1h，加1倍～2倍量的灭菌蒸馆水，摇匀，1000g离心

20min~30min，弃上清液，沉淀物加蒸馆水恢复量后再离心一次，取沉淀物涂片镜检、培养，安替福民

(antiformin）沉淀浓缩法具体操作参见B.4"

5.4染色镜栓

5.4.1涂片

先在玻片上涂布一层薄甘油蛋白，然后吸取处理好的样品滴加其上，涂布均匀。如被检样品为乳汁

等含脂肪较多的材料，在涂片制成后，滴加二甲苯或乙酶，使其覆盖整个涂片，摇动1min~2min脱脂

后倾去，再滴加95%酒精，以除去二甲苯，待酒精挥发后即可染色。甘油蛋白的配制方法参见A.4"

5.4.2蕾·尼氏（Ziehl-Neelsen）抗酸染色

涂片经火焰固定后，滴加苯盼复红染色液，使其覆盖整个涂片。之后，将玻片置于火焰上加热至出

现蒸汽但不产生气泡，保持热染色5min。如热染过程出现染色液干捆，应及时添加，适量补充。充分

水洗后滴加3%盐酸酒精脱色液，脱色30s~60s，至无色素脱下为止。充分水洗，以骆氏美蓝染色液复

3

GB/T18645-2020

染1min0水洗，吹干，镜检。妻－尼氏（Ziehl-Neelsen）抗酸染色配制方法参见A.50

5.4.3结果判定

在显微镜下，可见细长平直或微弯曲的红色杆菌，长1.5l'ffi~5l'ffi，宽0.2l'ffi~0.5l'ffi，即为阳

性。在陈旧培养基或干酷性淋巴结内，偶尔可见长达10l'ffi或更长菌体。否则判为阴性。

5.5分离培养和生化鉴定

5.5.1分离培养

将经过处理的病料接种到配氏培养基（参见A.的或改良L-J培养基（参见A.7）上，每份样品同时接

种2管～4管，在37℃培养1d后，以熔化的石蜡封口，继续培养至少8周〈一般10周～12周λ

结核分校杆菌在固体培养基上生长，菌落干燥、粗糙，呈自色、黄色或橙色。牛分枝杆菌在固体培养

基上菌落湿润、略显粗糙，加人1%的丙酣酸销可促进其生长。禽分校杆菌在固体培养基上形成湿润、

弥漫状、光滑菌落。结核分校杆菌和牛分枝杆菌在42℃不生长，禽分枝杆菌可在42℃生长a

5.5.2生化鉴定

5.5.2.1对硝基苯甲酸（PNB）试验

准备PNB培养基（参见A.8)1支，改良LJ培养基1支，每支培养基接种1月细菌s37℃孵育

4周，每周观察一次结呆并记录两种培养基上菌落的生长情况。牛分枝杆菌、结核分枝杆菌在PNB培

养基上不生长，禽分枝杆菌可在PNB培养基上生长g三种菌均可在改良L-J培养基生长因

5.5.2.2睡盼－2－竣酸脐（TCH）抗性试验

将细菌接种TCH培养基（参见A.9）和改良L-J培养基，37℃培养8周，1周后开始观察，每周观察

一次结果并记录两种培养基上菌落的生长情况．禽分枝杆菌、结核分枝杆菌可在TCH培养基上生长，

牛分校杆菌在TCH培养基上不生长s三种菌均可在改良L-J培养基生长。

5.5.2.3尿素酶试验

准备两支试管，试管A加入3mLPBS(pH6.7,1/15mol/L)（参见A.10）和1滴0.1%酷红指示剂

（参见A.11）；试管B加人用PBS(pH6.7,1/15mol/L）配制的0.12%尿素溶液（参见A.12）和