GB/T 14643.5-1993 工业循环冷却水中硫酸盐还原菌的测定 MPN法

中华人民共和国国家标准

工业循环冷却水中硫酸盐还原菌的测定GB/T14643.5一93

MPN法

Industrialcirculatingcoolingwater-Sulfate-reducingbacteria-MPNtest

1主题内容与适用范围

本标准规定了工业循环冷却水中硫酸盐还原菌的测定方法。

本标准适用于工业循环冷却水中硫酸盐还原菌的测定，也适用于原水、生活用水及粘泥中硫酸盐还

原菌的测定。

2引用标准

GB603化学试剂试验方法所用制剂及制品的制备

GB6682分析实验室用水规格和试验方法

3方法提要

本法采用多试管发酵技术，在29士1'C培养21d,如果试管内产生黑色沉淀并伴有硫化氢臭味的表

明阳性反应，采用MPN技术对被测试样中的硫酸盐还原菌进行计数。

4试剂和材料

本试验方法中，除特殊规定外，应使用分析纯试剂和符合GB6682中三级水的规格。

4.1磷酸氢二钾(HG3-1228);

4.2氯化钱(GB658);

4.3硫酸钠(GB9853);

4.4氯化钙;

4.5硫酸镁(GB671),

4.6乳酸钠;

4.了酵母汁:生化试剂;

4.9硫酸亚铁铁(GB661);

4.9维生素C;

4.10氯化钠(GB1266);

4.11氢氧化钠(GB629):40g/L溶液;

4.12盐酸(GB622):1+11溶液;

4.13硫代硫酸钠(GB637);

4.14乙醇(GB678):751(v/V)溶液;

4.15牛皮纸;

4.16医用脱脂棉。

国家技术监督局1993一08一06批准1994一07一01实施

cs/T14643.5一93

5仪器和设备

5.1无菌箱(室)或超净工作台;

5.2蒸汽压力灭菌器;

5.3生化培养箱;

5.4电热干燥箱:温度可控制在((60280)士20C;

5.5电热恒温水浴锅:恒温范围(37^100)士10C;

5.6刻度吸管:1mL;

5.7刻度吸管:5mL;

5.8试管:150mmX15mm并配上密封的塞子;

5.9试管架;

5.10刻度三角瓶:500mL;

5.11磨口三角瓶:l00mL;

5.12磨口试剂瓶:1OOOmL;

5.13容量瓶:1OOOmL,

6试验前准备

6.1无菌水的制备

将水分装在100mL磨口三角瓶中，每瓶40mL，每个三角瓶塞子和瓶口间插入一小纸片来防止粘

连，每个瓶子的瓶口均用牛皮纸包扎，以防污染，用燕汽压力灭菌器121士1℃灭菌15min,

6.2培养基的制备

6.2.1称取下列试剂:

磷酸氢二钾0.5g;

氯化按1.Og;

硫酸钠0.5g;

氯化钙0.1g;

硫酸镁2.Og;

乳酸钠3.5g;

酵母汁1.Og;

将上述试剂溶解在1OOOmL水中，用氢氧化钠溶液(4.11)或盐酸溶液((4.12)调节pH至7.2士0.

2，并分装在500mL刻度三角瓶中，每瓶不超过350mL，瓶口塞上棉塞，并用牛皮纸包好，用蒸汽压力灭

菌器121士1℃灭菌15min,

6.2.2硫酸亚铁按溶液:在培养基使用的当夭称取1.2g硫酸亚铁按，在无菌箱(室)内均匀地摊在离紫

外线灯30cm处灭菌30min，在无菌操作下，把硫酸亚铁按溶解于事先准备好的无菌水((6-1)中，混匀。

6.2.3维生素C溶液:在培养基使用的当天称取0.4g维生素C，在无菌箱(室)内均匀地摊在离紫外线

灯30cm处灭菌30min。在无菌操作下，把维生素c溶解于事先准备好的无菌水((6.1)中，混匀。

6.2.4在无菌操作下，按每100mL培养基(6.2.1)各加入1.OmL硫酸亚铁按溶液((6.2.2)和1.OmL

维生素C溶液((6.2.3),

6.3无菌稀释水的制备

6.3.，生理盐水的配制:称取s.50g氯化钠溶解在1OOOmL水中，混匀。

6.3.2将生理盐水(6.3.1)分装在100mL磨口三角瓶中，每瓶45mL，每个三角瓶塞子和瓶口间插人

一小纸片，塞紧瓶塞，每个瓶子的瓶口均用牛皮纸包扎以防污染，用蒸汽压力灭菌器121士1℃灭菌

15min

GB/T14643.5一93

6.4刻度吸管的灭菌

6.4.1将洗净并烘干后的吸管粗端塞上医用脱脂棉，棉花量要适宜，长度大约10-15mm，棉花不宜露

在口外，多余的棉花可以用火焰烧掉。

6.4.2每支刻度吸管用1条约40-50mm宽的牛皮纸条，以45’左右角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在

头部，粗端用多余纸条折叠打结，不使散开。标上度量，若干支扎成一束，置电热干燥箱中，于160士2C

灭菌2ho

6.5试管的灭菌

将洗净并烘干后的试管塞上密封的塞子，数支一捆，每捆管口用牛皮纸包扎，置电热干燥箱中，于

160士2'C灭菌2h,

66采样瓶的灭菌

将洗净并烘干后的1OOOmL磨口试剂瓶瓶口和瓶颈用牛皮纸裹好，扎紧，置电热干燥箱中，于160

士2C灭菌2ho

6了硫代硫酸钠灭菌

将硫代硫酸钠放在无菌箱(室)内，并均匀地摊在离紫外线灯30cm处灭菌30min,

了测定步骤

了.1水样的采集

7.1.1用无菌采样瓶采集被测样品，在取样过程中，要保护瓶口和颈部，防止这些部分受杂菌污染，瓶

内要灌满水样。

7.1.2若采集的水中有余氯，应在采样前，在无菌操作下，于无菌采样瓶(6.6)中加入硫代硫酸钠

(6.7)，加入量为每升水样约0.1go

7.1.3水样采集后，应立即进行测定，如果在2h内不能进行测定，应把水样放在冰箱中，于4^10℃保

存，存放时间不宜超过24h,经冷冻保存后的水样需测定时，从冰箱中取出，于30℃左右活化4-5h，再

进行测定。

7.2无菌箱(室)灭菌

把试验所用的无菌培养基、无菌稀释水、无菌吸管等用品放人无菌箱(室)内，打开紫外线灯灭菌

30min

7.3水样的稀释和接种

7.3门水样放入灭过菌的无菌箱(室)(7.2)中，立即用75%(v/v)乙醇溶液浸泡的医用脱脂棉球擦

手，点燃无菌箱(室)内的酒精灯。

7.3.27.3.7条操作应在无菌箱(室)内火焰区进行。

7.3.2选择适宜的稀释度，应使最后一个稀释度接种培养后无硫酸盐还原菌生长，在空白稀释水样瓶

(6.3)上标上稀释度数。_

7.3.3用10倍稀释法稀释水样，即用5mL无菌吸管(6.4)吸取5mL水样注人到45mL空白稀释水中

充分摇匀，此时稀释度为10-1,

7.3.49取一支5mL无菌吸管吸取5mL稀释度为10-，水样注人到第二个稀释水中，充分摇匀，此时

稀释度为10-1，依次类推，直至需要的稀释度为止。

7.3.5将水样(包括稀释水祥)分别接种于无菌试管(6.5)中，试管置试管架上，每个稀释度重复接种5

管(根据需要