RB/T 032-2020 基因扩增检测方法确认与验证指南

ICS03.120.00

A00

中华人民共和国认证认可行业标准

RB/T032-2020

基因扩增检测方法确认与验证指南

Guidanceonverificationandvalidationofgeneamplificationtestingmethods

2020-08-26发布2020-12-01实施

国家认证认可监督管理委员会发布

RB/T032-2020

目次

前

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…

方术规范

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RB/T032-2020

目。昌

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本标准起草单位：中国合格评定国家认可中心、大连海关技术中心、深圳华大基因科技有限公司、浙

江天科高新技术发展有限公司、沈阳海关技术中心、辽宁省疾病预防控制中心。

本标准主要起草人：李宏、刘淑艳、单耕、张娜、唐丹舟、姜华丰色、富宏坤、陈欢、付海滨、武维伟、

孙晓辰、曲晓明、王彦斌。

I

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基因扩增检测方法确认与验证指南

1范围

本标准给出了基因扩增检测方法确认与验证的指南。

本标准适用于实验室对基因扩增领域实验室制定的方法、超出预定范围使用的标准方法、其他修改

的标准方法的方法确认，以及实验室对新引人标准方法正式使用前的方法验证。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单〉适用于本文件。

GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度〉第2部分：确定标准测量方法重复

性与再现性的基本方法

ISO/IEC17025:2017检测和校准实验室能力的通用要求（Generalrequirementsforthecompe-

tenceoftestingandcalibrationlaboratories)

ISO/IEC指南99:2007国际计量学词汇基本和通用概念及相关术语[Internationalvocabulary

ofmetrology-Basicandgeneralconceptsandassociateterms(VIM)]

3术语和定义

ISO/IEC指南99:2007和ISO/IEC17025:2017界定的以及下列术语和定义适用于本文件。为了

便于使用，以下重复列出了ISO/IEC指南99中的某些术语和定义。

3.1

方法验证methodverification

实验室通过核查或试验，提供客观证据证明满足检测方法规定的要求。即提供客观证据以证明实

验室能够正确运用该方法，确保实现所帘的方法性能。

注1：适用时，应考虑测量不确定度。

注2：改自ISO/IEC指南99:2007，定义2.44.

3.2

方法确认methodvalidation

实验室通过试验，提供客观证据证明待定方法满足预期的用途。

注1：方法确认宜识别影响方法性能的因素及影响程度，验证方法的性能特性，并确定方法所适用的基质及使用的

限制条件。

注2：确认可包括对抽样、检测物品的处置和运输程序的确认。

注3：改自ISO/IEC指南99:2007，定义2.45.

3.3

定性方法qualitativemethod

直接或间接检测被分析物是否存在的分析方法。

RB/T032-2020

3.4

定量方法quantitativemethod

直接或间接测定被分析物数量的分析方法。

3.5

特异性specificity

方法区别目标序列与其他序列的能力。

3.6

检出限limitofdetection;LOD

被检测物能被可靠检出的最低浓度或含量。

注：改自ISO/IEC指南99:2007，定义2.4.18.

3.7

定量限limitofquantification;LOQ

被检测的样品在合适的精确度水平上能被检测出的最低含量或浓度。

注：引自GB/T19495.1-2004，定义3.1.6。

3.8

精密度precision

在规定条件下，对同一或类似被测对象重复检测所得测试结果的一致程度。

注1：精密度用于定义重复性和再现性。

注2：改自ISO/IEC指南99:2007，定义2.4.15.

3.9

重复性repeatability

在同一实验室，由同一操作员使用相同的设备，按照相同的测试方法，在短时间内对同一或类似被

测对象重复测试所得测试结果间的一致程度。

注：改自ISO/IEC指南99:2007，定义2.4.15,2.2.200

3.10

再现性reproducibility

在不同的实验室，由不同的操作员使用不同设备，按相同的测试方法，对同一或类似被视j对象重复

测试所得测试结果的一致程度。

注：改自ISO月EC指南99:2007，定义2.4.15和定义2.2.24.

3.11

重复性标准差repeatabilitystandarddeviation

在重复性条件下所得测试结果的标准差。

[GB/T6379.1-2004，定义3.15]

3.12

再现性标准差reproducibilitystandarddeviation

在再现性条件下所得测试结果的标准差。

[GB/T6379.12004，定义3.19]

3.13

真实度trueness

大量实验结果的平均值和认可参考值的一致性。

[GB/T19495.1-2004，定义3.1.8]

3.14

稳健度ruggedness

试验条件变化对分析方法的影响程度。

2

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[GB/T27417-2017，定义3.26]

注：这些条件在方法中规定，或根据规定稍加改动，包括样品种类、基质、保存条件、环境或样品制备条件等。在实

践中可能影响分析结果的实验条件（例如：试剂稳定性、样品组成、pH、温度等〉的任何变化都应指明。

3.15

测量不确定度measurementuncertainty

利用可获得的信息，表征赋予被测量量值分散性的非负参数。

注1：测量不确定度一般由若干分量组成。其中一些分量可根据一系列测量值的统计分布，按测量不确定度A类

评定进行评定，并可用标准偏差表征。而另一些分量可根据经验或其他信息所获得的概率密度函数，按测量

不确定度B类评定进行评定，也用标准偏差表征。

注2：通常，对于一组给定的信息，可以理解为测量不确定度与赋予被测量的设定值有关，该值的修改将导致相应的

不确定度的修改。

[ISO/IEC指南99:2007，定义2.4.26]

4方法确认

4.1总则

4.1.1在引人检测方法前，实验室应对其制定的方法、超出预定范围使用的标准方法或其他修改的标

准方法进行确认。

4.1.2实验室应制定并实施方法确认的技术方案，确认方案应尽可能全面，以满足预期用途或应用领

域的需要。按照技术方案进行实验室内方法确认及实验室间方法确认试验，完成确认结果的审查、评价

和审批

。

4.1.3方法确认涵盖样品制备（必要时，包括基因扩增样品的抽样），包括样品的前处理、DNA的提取

和纯化、DNA浓度的测定、DNA提取物中抑制剂去除、反应体系优化、扩增条件筛选及扩增结果的确

认等。

4.1.4实验室可采用下列一种或多种技术进行方法确认：

一一使用参考标准或标准物质评估偏倚和精密度；

一一对影响结果的因素做系统性评审；

通过改变控制参数检验方法的稳健性；

一一与其他已确认的方法进行结果比对等。

4.2特性参数的选择

实验室可在综合考虑成本、风险和技术可行性基础上，并根据预期的用途来进行方法确认。根据检

测方法的预期用途，选择需要确认的方法特性参数。典型的需要确认的方法特性参数见表1。

表1方法确认典型参数的选择

定量方法定性方法

待评估性能参数

特异性

、／.J

检出限.J.J

重复性

.J、／

再现性.J.J

其实度

.J、J

3

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表1（续〉

待评估性能参数

定量方法定性方法

稳健度、J.J

基质效应

、／、／

定量限.J

线性范围

、j

测量不确定度

、J

4.3确认方式

4.3.1实验室内方法确认

4.3.1.1一般原则

实验室内方法确认的目的是通过使用不同种类和类型的基质来证实待定方法的适用性。对于定性

方法，至少需要确认的技术参数包括方法的特异性、检出限和重复性；对于定量方法至少应确认方法特

异性、检出限、定量限、线性范围、真实度和稳健度等技术参数。

4.3.1.2测试样品的要求

根据方法规定预期用途，选择基质的种类和类型。每类基质测试样品的数量不少于60份，每种类

型测试样品的数量不少于20份。

示例1：如果待定方法仅适用于某类基质，则只需对该类基质进行确认。如果待定方法适用于多种基质，如食品，至

少选择5类食品，其中每类食品选择不少于3种不同类型样品（如未加工食品、初加工食品及深加工食品等〉进行测试研

究，不同类型样品各20份；植物样品可选择植株茎叶组织、籽粒、蔬菜、瓜果和牧草饲料等基质；动物样品可选择动物体

液（尿、血液、唾液、胆汁、胃液等〉毛发、指甲、肌肉及动物组织和器官等基质。

示例2：对于定性方法，理想状态是每种类型样品中有10份是阳性样本，10份是阴性样本，至少对于每一类基质，应

设置50%的阳性样本。全部阴性或阳性的样品水平是没有意义的．

4.3.2实验室间方法确认

4.3.2.1一般原则

实验室间方法确认是通过不同实验室使用相同的样品进行检测所得到结果的差异分析’，特别是当

该方法在实际应用过程中出现预期的系统及随机误差时，应对方法的性能指标做出实际的估计。

实验室间方法确认通常由8个协同实验室完成。特殊情况下，至少由5个协同实验室完成。对于

定性方法，至少要确认方法的检出限和特异性，对于定量方法，至少要确认方法的特异性、定量限、线性

范围和再现性。

4.3.2.2测试样晶的要求

由组织实验室制备统一的测试样品，并尽可能结合使用人工和自然污染样品。如没有自然污染样

品，可以使用人工污染的样品。基质的选择参见4.3.1.2.

对于定性方法，每一种基质至少包括3个测试水平的样本，包括阴性对照和两个测试水平的阳性样

品，至少有一个水平的样品设置为获得部分阳性的结果，依据概率分布，理论上，1个拷贝／样品的测试

水平应获得30%的阴性结果。因此，可以将其设置为低水平阳性样品，即1个拷贝／样品；另一个阳性

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RB/T032-2020

样品可依据检测方法的要求，设置为10个拷贝／样品或更高浓度。每个水平进行8次重复试验，即每个

协同实验室至少提供24个结果数据。

对于定量方法，每一种基质至少包括3个测试水平，并涵盖方法的测试范围，每个水平进行8次重

复试验，每个样本至少两次重复，即每个协同实验室至少提供48个结果数据。组织实验室负责数据的

统计分析，如有证据表明所获结果未严格按照检测方法或不满足检测条件要求，实验室应将该结果剔

除。数据剔除后，不需要对离群值进行统计分析。

注1：参与实验室间方法确认的实验室，相关的或类似的检测项目建议通过ISO17025:2017认可或具有其他等同

资质。

注2：用于实验室间方法确认的样本的数量及重复测试数的设计是基于检测方法与结果的准确度的考虑，详

见GB/T6379.2。

4.4特性参数的确认

4.4.1特异性

特异性的确认主要考虑三个因素：选择性、排他性和包容性。选择性是考察酶抑制剂、降解因子等

干扰物质的存在以及非特异性结合对分析特异性造成负面影响，详见附录A.排他性即方法能够检测

出目标物，而不能检测出所有可能发生交叉反应的其他物质。包容性即能够检测出密切相关的物种中

的相似的群，体现检测方法的应用范围。

确认从样品处理开始，至少测试30份已知目标物和30份已知近缘的或遗传信息相近的非目标物，

最低测试水平设置为检出限的10倍～100倍（如每个反应10个～100个拷贝的目标物或非目标物〉。

若出现非目标序列扩增、样品本底存在与目的片段大小一致的条带、非交叉污染导致的对照中出现意外

的条带、不能通过后续确认（如：酶切分析、测序、杂交、基因表达〉等情况，可判定特异性不能满足要求。

同时采用阴性样品经测试后，得出正确的阴性结果的比率来表征特异性CSP），见式(1）。对于Lo低污

染测试水平：

SP=(1一是）×100..(1)

式中：

P。一一阴性样品获得假阳性结果的数量F

N一一－Lo低污染水平的阴性结果数罩。

实验室依据目标基因的自身特点及基因扩增方法特性确定可接受的SP值。

注：基因扩增检测方法涉及研究对象繁多，目标基因序列的保守性的不同导致特异性确认的验收标准亦不同。如

细菌核糖体16sRNA前500bp的序列种内保守性极高，以其为目标基因建立的种水平的检测方法，其特异性

可达99%.

4.4.2检出限

通过量化样品中目标核酸的最小检测量来评估检出限，如通过己知浓度的被分析物标准品进行有

限稀释获得。当缺乏已知浓度的标准品时，可使用终点稀释法，对目标分析物进行系列稀释，每个稀释

度样品做两个平行，直到该稀释度中5%以上样品检测不到目标物，此时的稀释浓度就是方法的检

出限。

4.4.3精密度

4.4.3.1重复性

重复性是指实验室内精密度，即同一实验室在相同条件下获得一系列结果的一致性程度。对于基

因扩增反应来说，方法的重复性评估采用同一实验室检测相同样品（阳性或阴性），获得相同结果的比率

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表征。

4.4.3.2再现性

再现性是实验室间精密度，即不同实验室获得单个结果的一致程度。对于基因扩增反应来说，方法

的再现性评估采用再现条件下，检测相同样品（阳性或阴性〉，获得相同结果的比率表征。

4.4.3.3相对重复性标准偏差

在定量研究中，相对重复性标准偏差是一个有用的衡量精密度的工具，等于重复性标准偏差除以平

均值，通常《25%，并覆盖方法的动态范围。协同确认的结果可以使用再现性相对标准偏差和重复性相

对标准偏差来综合描述。

定量方法的重复性与再现性具体按GB/T6379.2中的方法进行计算，每个测试水平至少要获得16

个独立测试结果。通常情况下，重复性相对标准偏差应小于或等于再现性相对标准偏差。

4.4.4线性范围

、ν测试结果与测试样品中被分析物数量成比例时，被分析物增加则检测结果呈线性或成比例增加

或减少。采用不同浓度测试样品，绘制标准曲线，计算扩增效率和线性相关系数。标准曲线的设定至少

满足以下要求：

一一浓度覆盖预期使用的范围，并包含定量检测限；

一－5个浓度梯度；

一一每个浓度测试两个以上平行样品。

目标基因浓度可用目标基因成分百分比或拷贝数表示。

对定性和定量方法，标准曲线斜率的平均值通常要求在－3.6到－3.l之间，相当于扩增效率

90%～110%；线性相关系数的平均值应大于或等于0.98。

4.4.5定量限

定量限依据其定量原理，由标准样品模板拷贝数与Ct值（每个反应管内的荧光信号到达设定的域

值时所经历的循环数）间的线性关系所获得的绝对检测低限（拷贝数）和由内标基因拷贝数所获得的相

对检测低限（%）来表征。可使用终点稀释法，对目标分析物进行系列稀释，每个稀释度样品进行10个

平行测试，计算每个稀释度的标准偏差，在标准偏差满足ζ25%的条件下，能获得有效扩增结果的最低

稀释浓度为该方法的定量限。

4.4.6真实度

根据目标物的限量要求、方法的预期使用需要以及定量限的要求，选择较低浓度的目标物测试水平

进行真实度的评估。可以使用有证标准物质，至少选择2个浓度（如限量要求的浓度和定量限浓度）进

行评估，造用时，用线性范围的上限作为第3个浓度，至少要得到16个测试的结果。

无法获得有证标准物质时，可采用能力验证样品或能力验证的Z比分数来评价方法的真实度，但

能力验证样品指定值的确定应独立于能力验证活动，即参与实验室的公议值不能作为能力验证样品的

指定值用于真实度的评估。

通常，结果数据的相对标准偏差满足ζ25%，或Z比分数（标准分数〉在土2之间，可确认方法的真

实度满足要求。

注：真实度评估的具体试验方案依据样品的特性而定，对不宜在取的样品可采用2个浓度的8次重复获得16个测

试结果；对于容易获取的样本则也可采用2个浓度4个平行样品，每个样品2次重复测试在得16个测试结果。

也可采用其他等同的设计方案．

6

RB/T032-2020

4.4.7稳健度

稳健度可通过由实验室引人预先设计好的微小的合理变化因素，分析其影响而得出。分析稳健度

时，应关注以下内容：

a)识别方法中可能影响检测结果的因素，这些因素可以包括分析者、试剂（来源、保存时间、使用

剂量）、样品种类、DNA提取方式、扩增体系、扩增程序、仪器型号以及许多其他可能出现的

因素。

b)确定各个因素的影响，宜采用正交试验设计进行稳健度试验。

c)一旦发现对测定结果有显著影响的因素，应进一步试验，以确定这个因素的允许极限。对结果

有显著影响的因素应在标准方法中明确的注明。

4.4.8测量不确定度

需要时，可对基因扩增定量检测方法进行不确定度评估。对基因扩增结果的不确定度产生影响的

因素有很多，包括样品因素（类型、数量、纯度、干扰物质等〉、过程因素（样品处理、提取、扩增、产物分析’

等〉以及试验中所用设备（设备校准及移液器校准不确定度等〉及标准物质等引人的不确定度。

测量不确定度的评估通常包括以下内容：

a)检测方法的简要描述，包括用于计算结果的公式；

b)用于评估测量不确定度的数学模型；

c)对测量不确定度有贡献的分量分析；

d)每个测量不确定度分量进行分布计算评估；

e)用于整合标准不确定度的公式；

。扩展不确定度的计算；

g)结果数据的记录。

4.5记录

实验室方法确认记录应包括但不限于以下内容：

a)使用的确认方案；

b)确认的方法性能特性；

c)获得的结果及相关的技术记录；

d)方法有效性声明，并详述与预期用途的适宜性。

5方法验证

5.1总则

5.1.1实验室引人标准方法时，应对其能否正确运用这些方法的能力进行验证，并保存验证记录。验

证不仅需要识别相应的人员、设施和环境、设备等条件是否满足要求，还应通过试验证明操作该方法满

足标准的要求。如果发布机构修订了方法，应在所需的程度上重新进行验证。

5.1.2方法验证应从样品制备开始（必要时，包括基因扩增样品的抽样〉，包括DNA的提取和纯化、

DNA浓度的验证、反应体系、扩增条件及扩增结果等的验证。

5.1.3必要时，可进行实验室间比对。

注：经过严格确认的并被审批的集团化检测标准，集团内实验室经验证可以使用。

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RB/T032-2020

5.2验证参数的选择

方法验证过程中的关键参数的选择取决于方法的特性和要求，方法中有明确规定的则应对相应参

数进行验证。实验室应依据方法的适用范围，选择样品基质，并针对不同基质分别验证。通常情况下，

定量分析和定性分析方法验证的参数选择可参见表2，具体验证过程参见第4章。

表2方法验证参数的选择

定性方法

待评估性能参数定量方法

检出限·、j,J

重复性

、／、／

再现性·,J

真实度·,J

基质效应、／,J

定量限,J

线性范围.J

测量不确定度·.J

‘表示适用时，需要确认的性能参数。

注：、／表示正常情况下需要确认的性能参数；一表示正常情况下不需要确认的性能参数。

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RB/T032-2020

附录A

（资料性附录）

DNA提取物中抑制荆的检测

A.1DNA工作液的制备

将DNA提取物作为起始工作溶液，并将此工作溶液进行4倍系列稀释(1:4,1:16,1:64和

1:256），获得4份稀释液。检测抑制剂的PCR实验优先选择内源基因。起始工作溶液中总的DNA

应该至少和方法验证过程中及日常检测中用的DNA的量相同。

A.2抑制剂的检测及处理

采用实时荧光PCR对5份DNA样品溶液进行扩增分析，每个浓度至少设置2个PCR平行试验，

以稀释因子的对数值为横坐标（即－lg1/4,-lg1/16,-lg1/64和－lg1/256），对应的平均c.值为纵

坐标，绘制标准曲线。线性回归后计算以下三个参数：

一一斜率；

一一线性相关系数；

一－t£q值（起始工作液的c，值与通过