LY/T 2756-2016 白蜡品种分子鉴定方法—SRAP分子标记法

ICS65.020

B61

中华人民共和国林业行业标准

/—

LYT27562016

白蜡品种分子鉴定方法—

SRAP分子标记法

ㅤㅤㅤㅤ

MolecularidentificationmethodforfraxinusvarietieswithSRAP

()

seuence-relatedamlifiedolmorhismmolecularmarkers

qppyp

2016-10-19发布2017-01-01实施

国家林业局发布

/—

LYT27562016

白蜡品种分子鉴定方法—

SRAP分子标记法

1范围

本标准规定了白蜡品种分子鉴定方法—SRAP分子标记法的操作程序和分析方法。

()()。

本标准适用于利用相关序列扩增多态性SRAP法对白蜡品种种鉴定的实验过程

2原理

。(),

通过设计一对引物对白蜡基因组进行扩增正向引物含有个碱基对外显子

DNAF-rimer17

p

;(),、。

进行特异扩增反向引物含有个碱基对内含子区域启动子区域进行扩增因个体不同

R-rimer18

p

、。

以及物种的内含子启动子与间隔区长度不同而产生多态性最终通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将

,,

这些特异的多态性片段分离开来通过比较待测样品和对照品种DNA指纹谱带数据的差异来判断待

测样品与对照品种是否为相同品种。

3术语和定义

ㅤㅤㅤㅤ

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

相关序列多态性;

seuence-relatedamlifiedolmorhismSRAP

qppyp

(,),

利用一对引物对ORFsoenreadinframes开放阅读框进行扩增一对引物包括正向引物和反

pg

,、。

向引物因个体不同以及物种的内含子启动子与间隔序列长度不等而产生多态性

4仪器和设备

4.1PCR扩增仪。

4.2琼脂糖凝胶电泳系统。

4.3非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳系统。

4.4凝胶成像系统和照相系统。

4.5超纯水系统。

4.6低温高速冷冻离心机。

/。

4.7超微量紫外可见分光光度计

4.8高压灭菌锅。

4.9液氮罐。

4.10超低温冰箱。

()。

4.11高压电泳仪3000V稳压及配套电泳槽

()。

4.12移液器枪

1

/—

LYT27562016

5引物

引物相关信息见附录A。

6试剂与溶液

6.1主要常规试剂见附录B。

6.2非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂见附录C。

6.3银染试剂见附录D。

7操作程序

7.1鉴定材料

()。,,

选用不同品种种白蜡树新鲜叶片为材料提取基因组DNA选取适量样品装入冻存管液氮速

,,。

冻置于超低温冰箱中-70℃保存备用

7.2DNA的提取

。、、、

7.2.1采用CTAB法提取白蜡基因组DNA将干净研钵研杵小匙无水乙醇预先放入冰箱中

,、,。

-20℃预冷用自来水蒸馏水先后冲洗叶面再用滤纸吸干水分

ㅤㅤㅤㅤ

,,

取叶片在液氮中迅速研磨成粉状迅速转至灭过菌的离心管中加入

7.2.25~101.5mL500L

ggμ

()、(/),

预热过的CTAB提取液巯基乙醇和充分混匀后放入

60℃5L0.2%-5LRNaseA10mmL

μβμg

水浴。其间每隔轻轻摇动混匀次次。

65℃30min10min2~3

/(),,

7.2.3取出离心管加入等体积的氯仿异戊醇24∶1轻轻颠倒混匀10min再于台式冷冻离心机上

/离心。

12000rmin10min

,。

将上清液转入另一新的离心管中重复步骤次次

7.2.41.5mL7.2.31~2

移取上清液至另一已加入倍体积预冷(),

7.2.520℃以下无水乙醇的1.5mL离心管中轻轻颠倒混

,,。

匀使DNA沉淀成絮状-20℃放置30min以上

。

7.2.6用钩状玻璃棒轻轻挑出絮状沉淀并置于新的1.5mL离心管中如果样品未出现云雾状沉淀或

,/,。

看不清沉淀10000rmin离心10min再收集沉淀

,,/,

7.2.7加入1mL~1.5mL70%无水乙醇浸泡洗涤沉淀轻摇几分钟10000rmin离心10min收集

,。。

沉淀重复次然后将离心管水平放置在清洁场所晾干或在超净工作台上吹干

1

7.2.8风干后加入100L灭菌的TE缓冲液溶解沉淀。

μ

7.3DNA浓度的检测和定量

用缓冲液配制/、/、/、/和/的分子量标

TE1mL2.5mL5mL7.5mL10mLλ-DNA

μgμgμgμgμg

,,

准溶液各取3Lλ-DNA分子量标准溶液和3L步骤7.2中提取的未知浓度DNA溶液在0.8%琼

μμ

,,,,,

脂糖凝胶上电泳15min~20min稳压90V电泳缓冲液为1×TBE325nm紫外灯下观察照相通过

与标准溶液的荧光进行比较估测未知DNA的浓度。

,,

将步骤7.2中提取的DNA溶液取10L后在1.5mL离心管中用TE缓冲液稀释200倍然后放

μ

,,(),()

入石英比色杯中用紫外分光光度计检测记下其在和的光密度值值按式计

260nm280nmOD1

算出的浓度及和的比值。/应在之间。

DNAODODODOD1.8~2.0

260280260280

2

/—

LYT27562016

/……()

D=OD×n×5010001

260

式中:

———,(/);

DDNA的浓度单位为纳克每微升nL

gμ

OD260———260nm下的光密度值;

n———稀释倍数。

7.4PCR反应

7.4.1PCR反应体系

。,/,

在冰盘或4℃条件下进行操作25L反应总体系中含有10×PCR缓冲液2.5mmolL

μ

2+/,/,、/,,

M2.5mmolLdNTPs0.25mmolL正向反向引物各0.4molLTaDNA聚合酶0.5U模板

gμq

/。

DNA40nL

gμ

7.4.2PCR反应程序

;:,,

扩增程序首先是预变性然后前个循环为变性复性

94℃5min594℃1min37℃1min72℃

;:,,;

延伸随后的个循环为变性复性延伸最后延伸

1min3594℃1min50℃1min72℃1min72℃

,保存。

8min4℃

7.4.3PCR产物的处理

,,,。

PCR扩增反应结束后在25L的反应体系中加入5L的上样缓冲液摇晃混匀后备用聚丙

μμ

烯酰胺凝胶的制备。

ㅤㅤㅤㅤ

7.5聚丙烯酰胺凝胶的制备

7.5.1玻璃板的清洗

(),,,

用洗涤剂清洗玻璃板长板和短板自来水冲洗干净随后将玻璃板用蒸馏水冲洗次再用无屑

2

,。

纸巾沾取无水乙醇擦拭遍置于通风橱内垂直晾干待用

2

7.5.2胶槽装配

7.5.2.1玻璃板的固定

,,

将长板玻璃板平铺于通风橱内边条擦拭干净后置于长板玻璃板两侧随后用短板玻璃板整齐地压

,,。

盖住确认边条与两玻璃板均对齐后将其放入封胶框中并用夹子固定在制胶板上

7.5.2.2封胶

,,,

配制1%的琼脂糖凝胶煮沸后用胶头滴管吸取沿底边从左至右缓缓灌注入封胶框中避免出现

,,,。

气泡待琼脂糖凝胶完全漫过玻璃板底部停止灌注待其室温凝固后再进行下一步操作

7.5.3丙烯酰胺胶的配制

在30mL8%非变性聚丙烯酰胺贮备液中加入100L10%过硫酸铵和200L四甲基乙二胺

μμ

(),。

TEMED迅速轻轻混匀

7.5.4灌胶

,

固定有封好玻璃板的制胶板向后倾斜放置将配好的非变性聚丙烯酰胺工作液沿玻璃板壁缓

8%