GB/T 18649-2002 牛传染性胸膜肺炎(牛肺疫)诊断技术
GB/T 18649-2002 Diagnostic techniques for contagious bovine pleuropneumonia
基本信息
发布历史
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2002年02月
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2014年09月
-
2024年12月
研制信息
- 起草单位:
- 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
- 起草人:
- 白文彬
- 出版信息:
- 页数:10页 | 字数:18 千字 | 开本: 大16开
内容描述
GB/'r18649-2002
前言
牛肺疫是由丝状支原体丝状亚种(PG1)引起的一种牛属动物的传染病。健康牛和病牛接触由呼吸
道吸人病牛的“飞沫”,是本病的主要传染方式和感染途径。暴发流行时多呈急性病演,呼吸系统症状非
常明显,体温在41C以上稽留。但在病的常在地区多见亚急性和慢性病程,以地方流行性为特点。急性
期病变为浆液渗出性纤维素性胸膜肺炎,肺间质多孔多汁,肺小叶出现各期肝变、多色,呈大理石样肺,
肺胸膜和肋胸膜粘连,以及胸腔渗出液大量储留为特征。转为慢性后逐渐形成肺包膜或坏死块。慢性病
牛长期带菌,成为隐蔽的传染源。
在新发的地区对此病的检验应采取流行病学、临床学、血清学、病理学和病原学综合诊断方法为宜。
世界动物卫生组织[WorldOrganizationforAnimalHealth(英),OfficeIntentionaldesEpizootic(法),
OIE〕于1986年和1992年推荐采用稍加改进的Campbell和Turner的补体结合试验作为牛肺疫血清
学诊断的方法,但常出现非特异性反应。新中国成立后一直采用补体结合试验检验牛肺疫,并于1979年
将该法列人农业部颁布的动《物检疫操作规程》中,但这种方法常出现1%-2%非特异性反应。近年来
我国研制成功了特异性高的微量凝集反应检验方法,它不但降低了非特异性反应率,而且操作简便,容
易判定,应用效果良好。病原学诊断主要取病牛肺脏,胸腔渗出液和肺门淋巴结接种马丁培养基,即可分
离出牛肺疫病原体,此法对急性期病例的检出率可达100%.
本标准的附录A、附录B、附录C、附录D,附录E都是标准的附录。
本标准由中华人民共和国农业部提出。
本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。
本标准起草单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。
本标准主要起草人:白文彬。
中华人民共和国国家标准
GB/T18649-2002
牛传染性胸膜肺炎(牛肺疫)诊断技术
Diagnostictechniquesforcontagiousbovinepleuropneumonia
,范围
本标准规定了牛传染性胸膜肺炎的病原学检查、补体结合试验、微量凝集试验诊断技术要求。
本标准适用于牛传染性胸膜肺炎的检验。病原学检查适用于急性、亚急性及慢性病牛分离病原体,
补体结合试验和微量凝集试验适用于牛肺疫抗体的检测。
2病原学检查
2.1材料准备
培养基:10%马血清马丁肉汤,10写马血清马丁琼脂见〔附录A(标准的附录)」。
2.2病料采集
2.2.1用灭菌器械(剪刀、镊子、吸管、青霉素瓶等)无菌采集肺脏、胸腔渗出液、肺门淋巴结,并将肺病
料剪成3cm-5em方块。胸部淋巴结,以整个淋巴结为好,胸腔渗出液用吸管吸人青霉素瓶内。
2.2.2受检病料的保存:肺和淋巴结保存在用茶色广口瓶盛装的灭菌的40%50%甘油生理盐水中,
胸腔渗出液不加任何保存液。病料均放人冰箱内保存,并应尽快送往实验室检验。
2.3培养方法
在无菌条件下剪肺病料或淋巴结小块,用铂金耳钓人10%马血清马丁肉汤内;胸腔渗出液用灭菌
吸管吸取。1ml一。.3mL接种于马丁肉汤中即可。同时取剪碎病料小块或直接取胸腔渗出液,用铂金
耳在10%马血清马丁琼脂培养皿上划线接种,培养皿用胶布封口,置37'C-38'C培养,每天观察一次,
5d-7d后判定。
2.4结果判定
2.4.1培养特征
2.4.1门培养性状和菌落形态:牛肺疫病原微生物在10%马血清马丁肉汤内生长初期呈轻微混浊或
呈白色点状、丝状生长,以后逐渐均匀混浊,半透明稍带乳光,不产生菌膜或沉淀,也无颗粒悬浮。在
10%马血清马丁琼脂培养皿上生长迟缓,为极小的水滴状圆形略带灰色的微细菌落,中央有乳头状突
起。菌落直径约0.2mm-0.5mm,小的不易看见,需用放大镜或低倍显微镜观察。
2.4-1.2染色镜检取马丁肉汤培养物涂片放温箱中干燥,后在酒精灯上轻微火焰固定,再用3写-50o
铬酸蒸馏水溶液固定1min-2min,水洗,浸人用蒸馏水稀释的1,30的姬姆萨氏染液中染色,染片时
染色缸放人普通冰箱内过夜,染色后取出用蒸馏水轻洗,自然干燥后用800-1000倍显微镜观察。菌形
为多形态,以球点形最常见,大小在125nm-250nm,
2.4.2生化特性
2.4.2.1搪发酵试验
2.4.2.1.1取蛋白陈水(PH7.8-8.0)100mL,氯化钠0.5g所需各种糖类0.5g-1.0ga溶解各成
分,加人1.600嗅甲酚紫酒精溶液指示剂0.1ml混匀,分装三分管内装2ml,管内装有倒置的小玻璃
一一一一一一一-一一一
中华人民共和国国家质f监督检验检疫总局2002-02-19批准2002-05-01实施
GB/T18649-2002
管(杜汉氏发酵管)。经106.4kPa20min灭菌。
2.4.2.1.2在进行糖发酵试验时,首先将各种糖培养基小管加无菌的马血清0.2mL,再加受检的菌液
0.1ml,置37"C-38℃下培养5d-y7d,
24.2.1.3结果判定:牛肺疫菌可轻度分解葡萄糖、麦芽糖、糊精、淀粉产酸使培养基变黄,而不产气;
不能分解果糖、蔗搪、策糖、单奶糖和杨昔。
24.2.2硫化氢(H,S)试验
2.4.2.21乙酸铅纸条的制备:取滤纸剪成6.5cmX0.6cm大小的纸条,置平皿中,经112kPa
20min灭菌,烘干,再将滤纸条浸泡在灭菌的饱和乙酸铅溶液(10g乙酸铅溶于50mL沸蒸馏水中,即
为饱和乙酸铅溶液),浸透后取出,置无菌平皿内,37C烘干,保存于灭菌的试管中。
2.4-2-2.2试验方法:受试菌接种于10%马血清马丁肉汤或琼脂斜面上,取一片乙酸铅滤纸条,夹在
试管的棉塞下悬挂,置37℃培养5d--7d,滤纸条变黑或棕褐色者为阳性反应。
2.4-2.3硝酸盐还原试验
2.4.2.31培养基的准备:取营养肉汤或马丁肉汤100mL,硝酸钾(KNOO0.1g,调pH至7.8-8.0,
分装试验管,112kPa20min灭菌。
24.2.3.2试剂的准备:
试剂1,甲液:对氨基苯磺酸。.Sg,5mot/L乙酸100mL;乙液:a-蔡胺0.5g,5mol/L乙酸
100MI。
试剂2,二苯胺试剂:二苯胺0.5g溶于100mL浓硫酸中,用20mL蒸馏水稀释。
2.4-2-3.3试验方法。首先向硝酸盐培养液中加10%无菌马血清,然后将试验菌接种于硝酸盐培养基
中,同时设不接种的对照管,于37'C培养5d-7d。于5d和7d时取培养液少许放人干净的小试管中,
再各滴一滴试剂甲液和乙液.对照管同样加试剂。若试管菌液呈现红色,橙色者为阳性反应;如无红色出
现,则可加一二滴二苯胺试剂,若呈现蓝色反应,则表示培养基中有硝酸盐存在;如不呈蓝色反应,表示
硝酸盐和形成的亚硝酸盐已被还原成其他物质,则仍按硝酸盐还原试验阳性反应。
2.4.2.4靛基质试验
2.4-2-4.1培养基准备:蛋白脉1g,抓化钠0.5g,色氨酸。.1g,燕馏水100mL,溶解各成分,调pH
至7.88.0分装试管,经106.4kPa20min灭菌。
2.4-2-4.2试剂:对二甲基氨基苯甲醛5g,95%乙醇75mL,浓盐酸25mL。对二甲基氨基苯甲醛溶于
乙醇中,再缓缓加人浓盐酸即成。
2-4.2-4.3试验方法:先向培养基中加人10%无菌马血清,再将试验菌接种于培养基中,37℃培养
5d-7d后,滴加试剂数滴于培养物液面,轻轻摇动,红色为阳性反应。黄色为阴性反应。
2.4.2.5甲基红(MR)试验
2.4.2.5.1培养基:蛋白脉0.7g,j%萄糖0.5g,磷酸氢二钾。.5g,馏水100mL。各成分溶解后,调
pH7.8-8.0,分装试管。经106.4kPa20min灭菌备用。
2.4.2.5.2试剂:甲基红。02g,95%酒精60mL,燕馏水40mL。先将甲基红研磨溶解于酒精中,再加
燕馏水即成。
2.4-2.5.3试验方法:按10/0n量向培养基中加无菌马血清,再接种试验菌,37℃培养5d-7d。于第五
夭时取少许培养液于另一支试管中,并加几滴试剂,如培养液呈现红色为MR试验阳性;黄色者为阴
性,继续培养至第7天,再进行试验.
24.2.6维培二氏(VP)试验
Z4.2.6.1培养基与MR试验相同。
2.可用下列三种试剂进行VP试验
4.2.6.2试剂与方法:
40%氢氧化钾溶液。取MR试验的同一培养
a)Barritt's试剂法。甲液:6%a-蔡酚酒梢溶液。乙液:
物约2mI,加甲液1ml,乙液。.4mL,充分混合,在5min内呈粉红色反应为阳性。
Gs/T18649-2002
b)O'Meara's试剂法:氢氧化钾(或氢氧化钠)40g,肌配(creatine)0.3g,蒸馏水100mL。取上述
同一培养物约2ml_加等量试剂相混合,充分振荡试管,在5min内呈粉红色者为阳性反应。
。)硫酸铜试剂法,硫酸铜1g,浓氨水40mL,l0oo氢氧化钾960ml。硫酸铜溶化于40mL浓氨水
中,加10%氢氧化钾960ml即成。试验时加等量的试剂于培养物中棍合,在5min内呈粉红色反应为
阳性。上述三种方法为阴性,继续培养,再行
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