GB/T 31787-2015 香石竹环斑病毒分子生物学检测方法

ICS65.020.01

B16

中华人民共和国国家标准

/—

GBT317872015

香石竹环斑病毒分子生物学检测方法

MoleculardetectionofCarnationrinsotvirus

gp

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2015-07-03发布2015-11-27实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

发布

中国国家标准化管理委员会

/—

GBT317872015

前言

本标准按照/—给出的规则起草。

GBT1.12009

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Ⅰ

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GBT317872015

香石竹环斑病毒分子生物学检测方法

1范围

本标准规定了香石竹环斑病毒的、和实时荧光等分子生物学检测

RT-PCRIC-RT-PCRRT-PCR

方法。

本标准适用于植物种苗中携带的香石竹环斑病毒的检测。

2规范性引用文件

。,

下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文

。,()。

件凡是不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于本文件

/基因检验实验室技术要求

SNT1193

/进出境植物及植物产品检疫抽样

SNT2122

、

3仪器设备用具和试剂

3.1仪器设备

、、、(/)、、、

PCR仪实时荧光定量PCR仪超净工作台电子天平110000g电泳仪电泳槽凝胶成像系

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、、、、、、、。

统水浴锅高速冷冻离心机-80℃超低温冰箱高压灭菌锅制冰机微波炉漩涡振荡器

3.2用具

(、、、、)、离

可调式微量移液器2L10L100L200L1000L及相应的无RNase吸头无RNase

μμμμμ

心管、管和研钵等。

PCR

3.3试剂

(),()。

RT-PCR试剂见附录BIC-RT-PCR试剂见附录C

4症状观察及抽样

4.1症状观察

现场检疫主要观察进境植物材料上病毒为害的症状,为害症状描述参见附录。

CRSVA

4.2抽样

;,/,

发现有病毒为害症状的植物材料直接送检未发现症状的则按SNT2122中规定进行抽样并送

实验室进行病毒检测鉴定。

5病毒检测

5.1RT-PCR方法

,,

将送检植物样品中有疑似病毒为害症状的植物组织液氮研细取0.1g用于提取植物总RNA然后

1

/—

GBT317872015

,。。

反转录获得cDNA再进行PCR反应具体操作步骤见附录B

免疫捕获方法()

5.2RT-PCRIC-RT-PCR

,

将送检样品中有疑似病毒为害症状的植物组织放入研钵内研磨并按重量和病毒抽提缓冲液

,,。

1∶10的比例稀释制备的汁液分别盛装于离心管中离心后吸取上清液作为待测样品

,,,

用香石竹环斑病毒抗血清包被PCR管洗涤后在PCR管中加入制备的待测样品进行免疫捕获

,。。

然后反转录获得cDNA再进行PCR反应具体操作步骤见附录C

5.3实时荧光RT-PCR方法

,。。

采用5.1或者5.2方法获得cDNA进行实时荧光PCR反应具体操作步骤见附录D

6防污染措施

/。

香石竹环斑病毒分子生物学检测过程的防污染措施应符合SNT1193的规定制样用的研钵经

过洗涤液清洗后,干热处理。

160℃2h

7结果判定

、,

样品经RT-PCRIC-RT-PCR和实时荧光RT-PCR三种方法之一检测为阴性时证明样品不携带

香石竹环斑病毒。

,,

样品经或检测为阳性需要进行序列测定如果序列测定结果证实与所检测

RT-PCRIC-RT-PCR

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,。

的香石竹环斑病毒一致可判定样品携带香石竹环斑病毒

,。

样品经实时荧光RT-PCR检测为阳性时也可判定样品携带香石竹环斑病毒

8样品保存和结果记录

8.1样品保存

,。。

经检测确定携带香石竹环斑病毒的样品应妥善保存在-80℃冰箱中并做好登记和标记工作

,。

保存期满后需经灭活处理

8.2结果记录

:、、、、、、。

记录包括样品来源种类取样人员实验的时间地点方法和结果检验检疫员的签字等RT-

,

和检测应有电泳结果照片及序列测定分析结果实时荧光应有荧光曲线图

PCRIC-RT-PCRRT-PCR

与值。

Ct

2

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GBT317872015

附录

A

()

资料性附录

香石竹环斑病毒背景资料

A.1背景资料

A.1.1香石竹环斑病毒基本信息

:。

中文名香石竹环斑病毒

学名:。

Carnationrinsotvirus

gp

缩写:。

CRSV

:(),()。

分类地位番茄丛矮病毒科Tombusviridae香石竹环斑病毒属Dianthovirus

:,、

传播途径该病毒通过无性繁殖材料的运输进行长距离传播近距离主要是由于植物间的接触土

。。

壤污染和农事操作等引起病毒传播尚未见种传报道

A.1.2方法原理

,

用特异性抗体吸附待测样品中的病毒粒子后经高温裂解释放出病毒RNA或直接从待测样品材料

,,

中提取植物总然后在逆转录酶的作用下合成以为模板再通过普通或实时荧

RNAcDNAcDNAPCR

。。

光PCR进行检测分析PCR结果即可明确材料中是否含有香石竹环斑病毒的核酸成分

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A.2寄主范围

,,,

香石竹环斑病毒的实验寄主范围较自然寄主广在自然条件下CRSV主要侵染香石竹还可侵染

、、、、,:。

李树梨树苹果葡萄酸樱桃和甜樱桃等多种果树及果园里的杂草如繁缕

在实验条件下,,、,

可侵染科共种植物可系统侵染茄科豆科和葫芦科的植物非系统

CRSV25133

侵染的寄主范围更广。

A.3为害症状

、,,。

CRSV侵染香石竹引起叶片环斑斑驳导致叶和花的扭曲及畸变严重可致叶尖坏死当CRSV与

(),。。

香石竹斑驳病毒Carnationmottlevirus共同侵染时症状加重CRSV侵染果树的症状较轻且很难发现

,。

CRSV接种如下几种鉴别寄主可产生相应的症状可用来作为该病毒的鉴定方法之一

()():