DB12/T 465-2012 预防性健康检查 粪便中沙门氏菌、志贺氏菌的检测方法

ICS13.100

C75

DB12

天津市地方标准

DB12/T465—2012

预防性健康检查粪便中沙门氏菌、

志贺氏菌的检测方法

DetectionmethodsofSalmonellaandShigella

whoneedtopasspreventivehealthcheck

2012-11-14发布2013-02-15实施

天津市质量技术监督局发布

DB12/T465—2012

前言

本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的标准文本的格式和文字

进行编写。

本标准由天津市南开区疾病预防控制中心提出。

本标准起草单位：天津市南开区疾病预防控制中心、天津正大乾坤生物科技有限公司。

本标准主要起草人：柳光斌、陈金枝、庞作章、马均彪、王楠、于磊、沈宗林。

I

DB12/T465—2012

引言

本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到6.1.2条采便管与微生物采样增菌培

养管内容的采便套管和采便棒相关的专利的使用。

本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。

该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，

就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联

系方式获得：

专利持有人姓名：马均彪

地址：天津市南开区东马路新安花园A-1-604

请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利

的责任。

II

DB12/T465—2012

预防性健康检查粪便中沙门氏菌、

1

DB12/T465—2012

志贺氏菌的检测方法志贺氏菌的检测方法

1范围

本标准规定了预防性健康检查粪便中沙门氏菌、志贺氏菌的检测方法的术语和定义、设备和实验

器具、培养基和试剂、检验程序、操作步骤以及结果报告。

本标准适用于疾病预防控制机构和医疗机构对食品、公共场所等行业从业人员，进行沙门氏菌和志

贺氏菌健康带菌者的检测和确认。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

2.1

采便管Collectingpipe

由采便套管和采便棒构成的采便装置，采便套管内装有经钴60辐射灭菌的SN液体增菌液培养基。

2.2

带菌者Carriers

无任何临床表现，从粪便中分离到沙门氏菌（伤寒和副伤寒菌）或志贺氏菌的人群。

3设备和实验器具

3.1冰箱：4℃～8℃。

3.2恒温培养箱：36℃±1℃。

3.3电子天平：感量0.1g。

3.4锥形瓶:容量500mL，250mL。

3.5无菌培养皿：直径90mm。

4培养基和试剂

4.1沙门氏菌和志贺氏菌增菌液（SN）：见附录A中A.1。

4.2沙门氏菌、志贺氏菌（SS）琼脂培养基：见附录A中A.2。

4.3HE琼脂：见附录A中A.3。

4.4木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：见附录A中A.4。

2

DB12/T465—2012

4.5克氏双糖铁琼脂（KIA）见附录A中粪便A.5。

4.6三糖铁（TSI）琼脂：见附录A中粪便A.6。

4.7动力-吲哚-尿素（MIU）培养基：见附录A中A.7。

4.8蛋白胨水、靛基质试剂：见附录A中A.8。

4.9氰化钾（KCN）培养基：见附录A中A.9。

4.10赖氨酸铁琼脂（LIA）：见附录A中A.10。

4.11糖发酵管：见附录A中A.11。

4.12邻硝基酚β-D半乳糖苷（ONPG）培养基：见附录A中A.12。

4.13半固体琼脂：见附录A中A.13。

4.14丙二酸钠培养基：见附录A中A.14。

4.15沙门氏菌属O、H和Vi诊断血清。

4.16志贺氏菌属诊断血清

5粪便中沙门氏菌、志贺氏菌的检验程序

沙门氏菌、志贺氏菌的检验程序见图1：

3

DB12/T465—2012

粪便采集

接种SN增菌液

36℃±1℃18h～24h

HE或XLD或SS琼脂平板和

麦康凯琼脂平板分离

36℃±1℃18h～24h

挑取可疑菌落

接种KIA或TSI，及MIU、LIA

36℃±1℃18h～24h

血清学分型系统生化鉴定

报告

图1沙门氏菌、志贺氏菌检验程序图

6操作步骤

6.1粪便标本采集

6.1.1肛拭子采便手持灭菌直肠棉拭子先用无菌生理盐水中浸湿，由肛门插入直肠3cm～5cm处，旋

转360o采集后，将棉拭子手持端折断弃去，棉拭子端放入灭菌的SN增菌液培养管中。

6.1.2采便管采便手持采便管中的采便棒由肛门插入直肠3cm～5cm处，旋转360o采集后，将采便棒

放入灭菌的SN增菌液培养管中。

6.1.3现场留便体检者在现场自行留取约1g粪便并及时接种灭菌的SN增菌液培养基中。

6.2增菌

4

DB12/T465—2012

将肛拭子采便或采便管采便或自行留便的SN增菌液培养管，置36℃±1℃，培养18h～24h。

6.3分离

分别用接种环取增菌液一环，划线接种一个HE琼脂平板或XLD琼脂平板或SS琼脂平板和麦康凯琼脂

平板，于36℃±1℃培养18h～24h，观察各个平板上生长的菌落。各个平板上菌落特征见表1。

表1沙门氏菌属、志贺氏菌在选择性琼脂平板上的菌落特征

选择性平板沙门氏菌志贺氏菌

蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或

HE琼脂无色透明、半透明。

几乎全黑色。

菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全

XLD琼脂无色透明、半透明。

部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。

SS琼脂无色半透明，产硫化氢菌株菌落中心带黑色。无色透明、半透明。

麦康凯琼脂无色透明、半透明。无色透明、半透明。

6.4初步生化鉴定试验

6.4.1沙门氏菌（伤寒及副伤寒菌）的初步生化鉴定

自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种克氏双糖铁琼脂（KIA）或三糖铁（TSI）

琼脂和动力-吲哚-尿素培养基（MIU）及赖氨酸铁琼脂（LIA），于36℃±1℃，培养18h～24h。沙门氏

菌初步生化鉴定见表2。

表2沙门氏菌的初步生化鉴定

KIA（TSI）MIULIA

硫

气动吲尿赖硫初步判断

底层/斜面化氨化

体力哚酶

氢酸氢

A/K－＋＋－－＋＋可疑沙门氏菌属

A/K＋－/＋＋－－－－可疑沙门氏菌属

A/K＋＋＋－－＋＋可疑沙门氏菌属

A/A＋＋＋－－＋＋可疑沙门氏菌属

A/K＋＋＋＋－＋＋非沙门氏菌

A/A＋＋＋－－－＋非沙门氏菌

A/K＋＋＋－＋－＋非沙门氏菌

A/A＋－＋/－＋－＋/－－/＋非沙门氏菌

注：A：产酸（黄色）；K：不产酸（红色）；＋：阳性；－：阴性；＋/－：多数阳性；－/＋：多数阴性。

5

DB12/T465—2012

6.4.2志贺氏菌的初步生化鉴定

自选择性分离平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种克氏双糖铁琼脂（KIA）或三糖铁

（TSI）琼脂及动力-吲哚-尿素培养基（MIU）及赖氨酸铁琼脂（LIA）。每份标本应多挑几个菌落，

于36℃±1℃，培养18h～24h。志贺氏菌初步生化鉴定见表3。

表3志贺氏菌初步的生化鉴定

KIA（TSI）MIULIA

硫

气动吲尿赖硫初步判断

底层/斜面化氨化

体力哚酶

氢酸氢

A/K－※－－－/＋－－－可疑志贺氏菌属

注：1、A：产酸（黄色）；K：不产酸（红色）；＋：阳性；－：阴性；＋/－：多数阳性；－/＋：多数阴性。

2、※为福氏6型的某些生物型、鲍氏13及14某些生物型产气。

6.5血清学分型鉴定试验

6.5.1沙门氏菌血清玻片凝集试验

挑取符合沙门氏菌生化反应的KIA或TSI斜面上菌苔先与A～FO多价血清进行玻片凝集，凝集阳性者

（生理盐水不凝集），再选用O-2、O-4、O-7、O-8、O-9等因子血清凝集，沙门氏菌（伤寒和丙型副伤

寒菌）的Vi抗原能阻碍O抗原凝集，必要时制成浓菌悬液经100℃水浴30min破坏Vi抗原后，再进行抗O

血清的凝集。O抗原确定后再用H因子诊断血清凝集以确定菌型见表4。检出沙门氏菌（伤寒和丙型副伤

寒菌）以外的沙门氏菌时其抗原的鉴定可参见附录B（常见沙门氏菌抗原表）进行鉴定。沙门氏菌（伤

寒和丙型副伤寒菌）具有Vi抗原应与Vi诊断血清进行血清凝集试验。

表4沙门氏菌型抗原鉴定表

H抗原

菌种名称O抗原表面抗原

Ⅰ相Ⅱ相

甲型副伤寒沙门氏菌2a－－

乙型副伤寒沙门氏菌4b1,2－

丙型副伤寒沙门氏菌7c1,5Vi

伤寒沙门氏菌9d－Vi

注：—表示无此项抗原。

6.5.2志贺氏菌血清玻片凝集试验

a)挑取KIA(TSI)疑似志贺氏菌的培养物，先用志贺氏菌四种多价血清做玻片凝集试验。如呈现

凝集，则用B群（福氏）多价、D群（宋内）血清及志贺2型、志贺1型分别进行凝集试验。

b)与B群（福氏）多价血清凝集的培养物，则用群3，4、6、7，8因子血清进行凝集试验，根据

群因子血清的凝集的结果再选用1型～6型分型血清进行凝集试验，鉴定出型和亚型（见表6、表7）。

6

DB12/T465—2012

c)与志贺四种多价血清不凝集的培养物，应用C群鲍氏多价血清及1型～19型因子血清进行检

查。若鲍氏血清不凝集，再用A群3型～15型多价及分型血清进行检查。

d)若与上述血清均不凝集应进行生化鉴定，若生化反应符合志贺氏菌定义应注意该菌是否带有K

抗原，将该菌制成浓菌液100℃水浴30min（破坏K抗原）,待菌液凉至室温再进行血清学鉴定。

e)若四种多价血清凝集，而不与相应的分型血清凝集，且菌落粗糙，可用宋内Ⅱ相（粗造型）血

清做凝集反应,见表6、表7。

表6福氏志贺氏菌型和亚型的型抗原和群抗原鉴定表

群因子血清凝集

型和亚型型抗原

3，467，8

1aⅠ＋－－

1bⅠ＋＋－

1cⅠ－－＋

2aⅡ＋－－

2bⅡ－－＋

2cⅡ＋－＋

3aⅢ－＋＋

3bⅢ＋＋－

3cⅢ－＋－

4aⅣ＋－－

4bⅣ＋＋－

4cⅣ－－＋

5aⅤ＋－－

5bⅤ－－＋

6Ⅵ（＋）－－

X变种/－－＋

Y变种/＋－－

注：＋表示凝集；－表示不凝集；（＋）表示个别菌株系阴性反应。

表7福氏志贺氏菌的血清学简化鉴定表

在群因子血清中的凝集反应

可能的血清型

3，467，8

＋－－2a、1a、4a、5a、6、y

＋＋－1b、3b、4b

＋－＋2c

－＋＋3a

－＋－3c

－－＋1c、2b、4c、5b、X变种

－－－6、4

注：＋表示凝集；－表示不凝集。

7

DB12/T465—2012

6.6系统生化鉴定试验

6.6.1沙门氏菌的系统生化鉴定试验

6.6.1.1生化管鉴定法

自6.4.1初步判断结果营养琼脂平板上挑取可疑菌落，进行生化试验。采用传统生化管鉴定沙门氏

菌(伤寒及副伤寒菌)的鉴定见表8。

表8沙门氏菌的系统生化鉴定

葡硫靛卫木

动乳蔗尿甲基枸橼赖氨鸟氨

菌种名称萄化基VP茅胶酸脱酸脱

力糖糖素红酸盐

糖氢质醇糖羧酶羧酶

伤寒沙门氏菌＋＋－－＋/－－－＋－－＋＋＋－

甲型副伤寒沙门氏菌＋⊕－－－/＋－－＋－－＋－－＋

乙型副伤寒沙门氏菌＋⊕－－＋－－＋－＋/－＋＋＋＋

丙型副伤寒沙门氏菌＋⊕－－＋－－＋－＋＋＋＋＋

注：－：阴性（不产酸）；＋：阳性（产酸）；⊕：产酸产气；＋/－：多数阳性，少数阴性；－/＋：多数阴性，少数阳性。

6.6.1.2生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统法

根据6.4.1的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬

液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行沙门氏菌(伤寒及副伤寒菌)鉴定。

6.6.2志贺氏菌的系统生化鉴定试验

6.6.2.1生化管鉴定法

6.6.2.1.1自6.4.2初步判断结果营养琼脂平板上挑取可疑菌落，进行生化试验。即：葡萄糖铵，西蒙

氏柠檬酸盐，赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶，氰化钾（KCN）生长，以及水杨苷和七叶苷的分解。除宋内氏菌

和鲍氏13型为乌氨酸阳性外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。必要时还应做革兰染色检查和氧化酶

试验，应为氧化酶阴性的革兰阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生

凝集，仍不得判定为志贺氏菌属的培养物。

6.6.2.1.2已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做5%乳糖发酵，甘露醇、棉子糖和甘油的发酵和

靛基质试验。志贺氏菌属四个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。但福氏6型的生化特性与A群或

C群相似，见表9。

表9志贺氏菌的系统生化鉴定

生化群5%乳糖甘露醇棉子糖甘油靛基质

A群：痢疾志贺氏菌---（+）-/+

B群：福氏志贺氏菌-++-（+）

C群：鲍氏志贺氏菌-+-（+）-/+

D群：宋内氏志贺氏菌+/（+）++d-

注：+：阳性；-：阴性；-/+：多数阴性，少数阳性；（+）：迟缓阳性；d：有不同生化型。

8

DB12/T465—2012

6.6.2.2生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统法

可根据6.4.2的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌

悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行志贺氏菌鉴定。

6.7结果报告

综合上述生化试验和血清学鉴定的结果判定菌型，并报告粪便标本中检出或未检出沙门氏菌(伤寒

及副伤寒菌)或志贺氏菌。

9

DB12/T465—2012

AA

附录A

（规范性附录）

培养基和试剂

A.1沙门氏菌和志贺氏菌增菌液（SN）

A.1.1成分

蛋白胨5.0g

乳糖4.0g

磷酸氢二钠10.0g

亚硒酸氢钠4.0g

L-胱氨