DB22/T 1607-2012 化妆品中单核细胞增生李斯特氏菌检测

ICS65.020.30

B40

备案号：35741-2013DB22

吉林省地方标准

DB22/T1607—2012

化妆品中单核细胞增生李斯特氏菌检测

Detectionoflisteriamonocytogenesincosmetics

2012-12-01发布2013-01-01实施

吉林省质量技术监督局发布

DB22/T1607—2012

前言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。

本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。

本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。

本标准主要起草人：孟日增、王宁、丁旭、刘韬、宋战均、刘金华、蔡阳、罗雁非。

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DB22/T1607—2012

化妆品中单核细胞增生李斯特氏菌检测

1范围

本标准规定了单核细胞增生李斯特氏菌的检测方法。

本标准适用于化妆品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB7918.1化妆品微生物标准检验方法总则

3试剂和材料

3.1水：为符合GB/T6682的灭菌二级水。

3.2Half-Fraser培养基：见附录A.1。

3.3Fraser肉汤：见附录A.2。

3.4牛津琼脂（Oxford琼脂）：见附录A.3。

3.5ALOA琼脂：见附录A.4。

3.6胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂(TSA-YE)：见附录A.5。

3.7胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤(TSB-YE)：见附录A.6。

3.8绵羊血琼脂：见附录A.7。

3.9糖类利用肉汤（鼠李糖和木糖）：见附录A.8。

3.10CAMP（Christle，Atkins，Munch-Petersen）培养基及试验菌株：见附录A.9。

3.11过氧化氢溶液：见附录A.10。

3.12磷酸盐缓冲液（PBS）：见附录A.11。

4仪器和设备

4.1恒温培养箱：25℃±1℃，30℃±1℃，35℃±1℃。

4.2恒温水浴锅：46℃±1℃。

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4.3均质器或灭菌乳钵。

4.4显微镜：10X～100X。

4.5接种环、接种针。

4.6灭菌试管：18mm～180mm。

4.7灭菌吸管：10mL（具有0.1mL刻度）和1mL（具有0.1mL刻度）。

4.8灭菌量筒：容量100mL和250mL。

4.9灭菌培养皿：直径90mm～100mm。

5检验程序

单核细胞增生李斯特氏菌检测程序见图1。

检样（10mL）

＋

初次增菌培养基（Half-Fraser90mL）

30℃±1℃培养24h±2h

二次增菌培养基（Fraser10mL）选择性分离培养基（牛津、ALOA）

35℃±1℃培养48h±2h35℃±1℃培养48h±2h

选择性分离培养基（牛津、ALOA）接种木糖、鼠李糖

35℃±1℃培养24h±2h

35℃±1℃培养48h±2h

木糖-，鼠李糖+

接种木糖、鼠李糖

35℃±1℃培养24h±2h纯化、鉴定

木糖-，鼠李糖+纯化、鉴定

图1单核细胞增生李斯特氏菌检测程序

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6操作步骤

6.1样品稀释液制备

按照GB7918.1中的规定执行。

6.2增菌培养

初次增菌，取1:10样品稀释液10mL加到90mlHalf-Fraser液体培养基中，置30℃±1℃培养24

h±2h。二次增菌，取0.1mL初次增菌的培养物，加入到10mLFraser培养液中，置35℃±1℃培养

48h±2h。

6.3分离培养

用接种环取培养过的Half-Fraser增菌液的表层培养物划线接种于牛津琼脂和ALOA琼脂两种选择

性平板上。将二次增菌培养物按同样步骤，划线接种于牛津琼脂和ALOA琼脂选择性平板上。置35℃

±1℃培养48h±2h。经48h恒温培养后，检查平板上有无可疑单核细胞增生李斯特氏菌菌落。培养24

h的典型李斯特氏菌在牛津琼脂上为细小（1mm）的灰色菌落，其外围有黑色晕圈，48h后菌落变暗，

可见绿色光泽，直径约2mm，有黑色的晕圈并且中间凹陷。典型单核细胞增生李斯特氏菌在ALOA琼

脂上为蓝绿色菌落，颜色较为鲜艳，菌落直径1mm，菌落较小，圆形规则，边缘整齐，有较为明显不

透明晕圈。

6.4糖发酵反应

从每种选择性培养基的每一平板中选择5个以上疑似单核细胞增生李斯特氏菌的菌落。如果一只平

板中少于5个疑似菌落，须确挑去所有菌落，分别接种在木糖和鼠李糖发酵管中35℃±1℃培养24h

±2h；同时在TSA-YE上划线纯化，置30℃±1℃培养24h～48h。选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培

养物继续进行鉴定。

6.5鉴定

6.5.1纯培养

6.4中纯化培养的TSA-YE平板。

6.5.2过氧化氢酶试验

在TSA-YE琼脂平板中取单个菌落，悬浮于玻片上一滴过氧化氢溶液中产气泡者为阳性反应。

6.5.3革兰氏染色

从TSA-YE琼脂平板中取单个菌落进行革兰氏染色，单核细胞增生李斯特氏菌为革兰氏阳性，狭

长短棒状；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌呈现轻微旋转或翻滚样运动。

6.5.4协同溶血试验（CAMP）

在绵羊血平板上相对平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌培养物（R.equi），接种线必须窄而均匀，

可通过用接种环和金属线与琼脂平面呈直角的方向（垂直）接种而得。在它们两个培养物中间靠近1

mm~2mm处垂直接种可疑的单核细胞增生李斯特氏菌，但不能与二者接触。几个试验菌株应该同时接

种于同一平板内。同样，垂直接种对照菌株（单核增生李斯特氏菌、西尔李斯特氏菌、英诺克李斯特氏

菌）。如果使用血琼脂，则需35℃±1℃或37℃±1℃培养18h-24h。待验菌株与金黄色葡萄球菌和

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马红球菌间β-溶血作用增强者均可认为是阳性反应。单核细胞增生李斯特氏菌或西尔李斯特氏菌在靠

近金黄色葡萄球菌接种点附近的溶血增强，绵羊李斯特氏菌在靠近马红菌接种点附近的溶血增强，可见

明显的箭头状溶血现象，其他单核细胞增生李斯特氏菌不产生溶血现象。

6.5.5生化鉴定

将上述可疑菌做进一步的生化实验，单核细胞增生李斯特氏菌与其它李斯特氏菌的区别见表