DB51/T 868-2009 马铃薯卷叶病毒、马铃薯Y病毒和马铃薯A病毒检验鉴定技术规程

65.020.99

B19DB51

四川省地方标准

DB51/T868—2009

马铃薯卷叶病毒、马铃薯Y病毒和

马铃薯A病毒检验鉴定技术规程

InspectionandIdentificationRulesofPotatoLeafrollVirus，PotatoVirusYand

PotatoVirusA

2009-03-05发布2009-03-10实施

四川省质量技术监督局发布

DB51/T868—2009

目次

前言.................................................................................II

1范围................................................................................1

2规范性引用文件......................................................................1

3术语和定义..........................................................................1

4原理................................................................................1

5试剂与材料..........................................................................2

6仪器及用具..........................................................................3

7田间调查及取样......................................................................3

8实验室检验..........................................................................4

9结果判定............................................................................4

10除害处理...........................................................................4

附录A（规范性附录）马铃薯卷叶病毒DAS-ELISA检验程序.................................6

附录B（规范性附录）马铃薯Y病毒CompoundELISA检验程序...............................7

附录C（资料性附录）马铃薯A病毒CompoundELISA检验程序...............................8

附录D（规范性附录）马铃薯卷叶病毒RT-PCR法检验程序..................................9

附录E（规范性附录）马铃薯Y病毒RT-PCR法检验程序....................................11

附录F（规范性附录）马铃薯A病毒RT-PCR法检验程序....................................13

附录G（规范性附录）马铃薯卷叶病毒、马铃薯Y病毒和马铃薯A病毒为害症状...............15

I

DB51/T868—2009

前言

本标准附录A、附录B、附录C、附录D、附录E和附录F为规范性附件，附录G为资料性附录。

本标准由四川省农业厅提出并归口。

本标准起草单位：四川省农业厅植物检疫站、四川出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：宁红、郭迪金、张洪峰、孟兴、谢成伦、黄玲、熊玉兰。

II

DB51/T868—2009

马铃薯卷叶病毒、马铃薯Y病毒和

马铃薯A病毒检验鉴定技术规程

1范围

本标准规定了马铃薯卷叶病毒、马铃薯Y病毒和马铃薯A病毒的实验室检验、检测和鉴定技术要求。

本标准适用于马铃薯块茎、种苗和其它茄科植物感染马铃薯卷叶病毒、马铃薯Y病毒和马铃薯A病

毒的检验、检测和鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的

修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究

是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB7331－2003马铃薯种薯产地检疫规程

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1

马铃薯卷叶病毒potatoleafrollvirus

简称PLRV，属黄症病毒科，马铃薯卷叶病毒属。病毒粒体呈球状，直径25nm，是等轴对称病毒，

致死温度70℃，稀释限点约10-4，引起马铃薯卷叶病。

3.2

马铃薯Y病毒potatovirusY

简称PVY，属马铃薯Y病毒科，马铃薯Y病毒属。病毒粒体呈弯曲长杆状，为单链RNA病毒，长730

nm，致死温度52℃～62℃，稀释限点为10-3～10-2，引起马铃薯重花叶病，是引起马铃薯退化的主要病

毒。

3.3

马铃薯A病毒potatovirusA

简称PVA，属马铃薯Y病毒科，马铃薯Y病毒属。病毒粒体呈弯曲长杆状，为单链RNA病毒，长730

nm，致死温度44℃～52℃，稀释限点为2.5×10-2～10-1，引起马铃薯轻花叶病。

3.43.4

目标条带targetband

根据某种病毒RNA序列中一段保守的、特异的碱基序列设计特异引物，通过RT-PCR扩增和电泳检

测，得到的与引物设计长度吻合的RT-PCR扩增条带。目标条带的存在，是判断某种病毒存在的标准。

4原理

马铃薯卷叶病毒、马铃薯Y病毒和马铃薯A病毒田间通过蚜虫和农事操作进行传播，远距离传播主

要通过人为的引种、商品流通等，带毒块茎和种苗是该病毒传播的主要载体，采用免疫学和分子生物学

方法，对病毒载体进行检验，并根据有关判断标准进行马铃薯卷叶病毒、马铃薯Y病毒和马铃薯A病毒

检验鉴定。

1

DB51/T868—2009

5试剂与材料

除非另有说明，在本标准中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。

5.1ELISA检验试剂

5.1.1捕捉抗体（Captureantibody）

5.1.1.1PLRV捕捉抗体：即PLRV免疫球蛋白，按市售产品要求进行稀释，贮藏于4℃备用。

5.1.1.2PVY捕捉抗体：即PVY免疫球蛋白，按市售产品要求进行稀释，贮藏于4℃备用。

5.1.1.3PVA捕捉抗体：即PVA免疫球蛋白，按市售产品要求进行稀释，贮藏于4℃备用。

5.1.2酶标抗体（Enzymeconjugate）

5.1.2.1PLRV酶标抗体：由碱性磷酸酶标记的PLRV的免疫球蛋白抗体。

5.1.2.2PVY酶标抗体：由鼠抗PVY的探测抗体和碱性磷酸酶标记的兔抗鼠的PVY免疫球蛋白组成。

5.1.2.3PVA酶标抗体：由鼠抗PVA的探测抗体和碱性磷酸酶标记的兔抗鼠的PVA免疫球蛋白组成。

5.1.3包被缓冲液（Coatingbuffer）：取2.93g碳酸氢钠（NaHCO3）、1.59g碳酸钠（Na2CO3）、0.2

g叠氮化钠（NaN3），用1000mL蒸馏水溶解，并调pH值到9.6，贮藏于4℃备用。

5.1.4洗涤液(PBSTBuffer)：取1.15g磷酸氢二钠（Na2HPO4）、0.2g氯化钾（KCl）、0.2g无水磷酸

二氢钾（KH2PO4）、8g氯化钠（NaCl）、0.5g吐温－20，用1000mL蒸馏水溶解，并调整pH值到7.4。

5.1.5样品提取液（GEB）：取1.3g硫酸钠（Na2SO4）、20.0g聚乙烯吡咯烷酮（（C6H9NO）24-40000）、

0.2g叠氮化钠（NaN3）、2.0gII级鸡蛋清白蛋白粉、20.0g吐温－20，用1000mL洗涤液溶解，并调整

pH值到7.4，贮藏于4℃备用。

5.1.6酶标抗体稀释缓冲液

5.1.6.1ECIBuffer：取0.2g牛血清白蛋白、2.0g聚乙烯吡咯烷酮（（C6H9NO）24-40000）、0.02g叠氮

化钠（NaN3）用100mL洗涤液溶解，并调整pH值到7.4，贮藏于4℃备用。

5.1.6.2ECMBuffer：取脱脂奶粉0.4g用100mL洗涤缓冲液溶解，并调整pH值到7.4，贮藏于4℃

备用。

5.1.7酶标抗体溶液

5.1.7.1PLRV酶标抗体溶液：用酶标抗体稀释缓冲液ECIBuffer，按市售产品要求稀释PLRV酶标

抗体，贮藏于4℃备用。

5.1.7.2PVY酶标抗体溶液：用酶标抗体稀释缓冲液ECMBuffer，按市售产品要求稀释PVY酶标抗

体，贮藏于4℃备用。

5.1.7.3PVA酶标抗体溶液：用酶标抗体稀释缓冲液ECIBuffer，按市售产品要求稀释PVA酶标抗体，

贮藏于4℃备用。

5.1.8底物缓冲液（PNPBuffer）：用80mL灭菌蒸馏水将0.01g氯化镁（MgCl2）、0.02g叠氮化钠

（NaN3）、9.7mL二乙醇胺（C4H11NO2）溶解后，调pH值到9.8，定容到100mL，贮藏于4℃备用。

5.1.9底物溶液（PNPsubstrate）：将5mg对硝基苯磷酸钠（C6H4O6PNa2·6H2O）溶解于5mL底物

缓冲液中。底物溶液制备需在孵育结束前10min内，避光条件下制备。

5.1.10终止液：12g氢氧化钠（NaOH）溶于100mL蒸馏水。

5.2RT-PCR检验试剂

5.2.1莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶（MMLV）100u/µL。

5.2.21×TAE缓冲液：40mMTris-HCl，20mMNaAc，2mMEDTA(用冰醋酸调pH至8.0)。

5.2.35×RT缓冲液：50mMTris-HClPH=7.5，100mMNaCl，0.1mMEDTA，10mMDTT，0.01%

NP-40，50%甘油（C3H8O3）。

5.2.410×PCR缓冲液：100mMTris-HCl(pH8.3)，500mMKCl。

5.2.5MgCl225mM。

5.2.6RNA酶抑制剂（RNasin）10u/µL。

5.2.7RT增强剂（RTEhancer）。

2

DB51/T868—2009

5.2.8无水乙醇（C2H6O）。

5.2.9RL裂解液（RLLysate）。

5.2.10去蛋白液（protein-freesupernatant）。

5.2.11Taq酶（Taqenzyme）2.5u/µL。

5.2.12dNTPMixture10mM。

5.2.13漂洗液（Rinsedfluid）。

5.2.14双蒸水（ddH2O）。

5.2.15溴酚蓝（Bromophenolblue）C19H10Br4O5S。

5.2.162-巯基乙醇（MCE）C2H6OS。

5.2.17液氮（N2）。

5.2.18