DB37/T 3801-2019 花生品种纯度鉴定技术规程—SSR标记法

ICS65.020.01

B05

DB37

山东省地方标准

DB37/T3801—2019

花生品种纯度鉴定技术规程—SSR标记法

Protocolofpurityidentificationforpeanutvarietyusing

SSRmarkers

2019-12-24发布2020-01-24实施

山东省市场监督管理局发布

DB37/T3801—2019

目次

前言................................................................................II

1范围..............................................................................1

2规范性引用文件....................................................................1

3术语和定义........................................................................1

4原理..............................................................................2

5仪器设备..........................................................................2

6试剂..............................................................................2

7溶液配制..........................................................................2

8引物信息..........................................................................2

9操作步骤..........................................................................2

9.1样品准备......................................................................2

9.2单粒种子的DNA提取............................................................2

9.3PCR扩增.......................................................................3

9.4PCR产物检测...................................................................3

10判定方法与原则...................................................................4

10.1判定方法.....................................................................4

10.2判定原则.....................................................................4

附录A（规范性附录）溶液配制........................................................5

附录B（资料性附录）推荐引物........................................................7

附录C（资料性附录）参照品种名单....................................................9

I

DB37/T3801—2019

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。

本标准由山东省农业标准化委员会归口。

本标准起草单位：山东省花生研究所。

本标准主要起草人：单世华、闫彩霞、赵小波、李春娟、王娟、苑翠玲、孙全喜、宋秀霞。

II

DB37/T3801—2019

花生品种纯度鉴定技术规程-SSR标记法

1范围

本标准规定了利用简单重复序列（Simplesequencerepeat，SSR）标记法进行花生（Arachishypogaea

L.）品种鉴定的原理、仪器设备及试剂、操作步骤、判定方法与原则。

本标准适用于试验样品为种子的花生品种的纯度鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

品种纯度Varietypurity

品种在SSR标记带型上典型一致的程度，反映鉴定品种的特征特性。

3.2

简单重复序列Simplesequencerepeat（SSR）

由几个核苷酸（1～6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp（一般为100～200）的串联

重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其多态性主要来源于串联数目的不同。

3.3

推荐引物Recommendedprimer

根据最少引物区分最多品种的原则，筛选出多态性高，条带清晰、重复性好的一套SSR引物。

3.4

参照品种Referencevariety

具有推荐SSR位点上不同等位变异的花生品种，用于辅助确定送检样品的等位变异，校正仪器设备

的系统误差。

1

DB37/T3801—2019

4原理

不同花生品种由于遗传组成不同，基因组中重复单位的数目存在差异，造成了品种间的多态性。可

根据其两端的高度保守序列设计特异引物，通过PCR扩增及电泳检测，从而鉴定花生品种的纯度。

5仪器设备

高压灭菌锅（105℃～136℃，最大工作压力0.22MPa）；凝胶自动扫描仪（400百万像素）；高

速冷冻离心机（最大离心力不小于15000g）；PCR扩增仪（0℃～100℃）；紫外分光光度计（波长190

nm～1100nm）；恒温水浴锅（室温～99℃）；水平摇床（0rpm～230rpm）；微波炉（耐温120℃）；

电子天平（最小显示0.01g）；电泳槽（样品通量1.0mm厚）；磁力搅拌器（0r/min～2500r/min，

室温～100℃）；酸度计（-2.00～20.000pH）；微量移液器（2µl、10µl、100µl、200µl、500µl

和1000µl）。

6试剂

乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na2）；三羟基甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl，36%）；十六烷基三

甲基溴化铵（CTAB）；氯化钠（NaCl）；硼酸（Borate）；丙烯酰胺；甲叉双丙烯酰胺；四甲基乙二胺

（TEMED）；无水乙醇；过硫酸铵（APS）；硝酸银（AgNO3）；琼脂糖；6×loadingbuffer；GoldView

-1

染料；RNAase（10ug•µL）；酚:氯仿:异戊醇（体积比25:24:1）；异丙醇；四硼酸钠；甲醛；2×Frements

-1

Mix；SSR引物（10μmol•L）；20bpDNALadder；重蒸水或符合GB/T6682规定的一级水。除特殊说

明外，所用试剂均为分析纯试剂。

7溶液配制

相关溶液配制方法见附录A。

8引物信息

推荐引物的序列信息与等位变异见附录B。

9操作步骤

9.1样品准备

鉴定样品的分样和保存，应符合GB/T3543.2的规定。随机取100粒花生种子，取其父母本材料各10

份，另取参照品种（见附录C）各2粒。水培法种植，至第三片真叶长出后备用。

9.2单粒种子的DNA提取

9.2.1DNA提取

取单株幼苗的根、茎、叶等器官50mg，放入1.5mL离心管中，液氮研磨。CTAB法提取基因组DNA，

加入100µl1×TE（pH8.0）溶液溶解DNA。完全溶解后每管加入5µlRNAase，37℃温育1h，－20℃

保存留用。

2

DB37/T3801—2019

9.2.2DNA浓度和质量检测

测定DNA溶液的OD260/OD280值，确保在1.7～2.0范围内。测定其OD260的吸光度，以1个OD260值相当于50

mg•L-1DNA浓度来计算纯化DNA的浓度。用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，GoldView染料进行染

-1

色。稀释至工作浓度为30ng•μL，置于4℃备用。

9.3PCR扩增

9.3.1反应体系

总体系为10μL，包括1.5μLDNA，1.9μL水，5μL2×FrementsMix，0.8μLF/R引物，混匀。

9.3.2反应程序

95℃预变性3min；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，进行35个循环；72℃延伸

5min；4℃保存备用。

9.4PCR产物检测

9.4.1非变性聚丙烯酰胺凝胶制备

9.4.1.1玻璃板组装

清洗玻璃板和52齿梳，晾干；用95%乙醇擦凹板和平板，两板间插入1.0mm厚的边条，对齐，夹紧，

凹板朝上，水平放置，用水平仪调平。

9.4.1.2灌胶

在小烧杯中加入7.5mL6%聚丙烯酰胺凝胶溶液、37mL水，然后加500μL10%APS及20μLTEMED，

轻轻摇匀，防止产生气泡；迅速灌胶，将梳子齿朝外，轻轻插入胶中，至凹板玻璃面约0.8cm处，静置

1h。

9.4.2电泳检测

9.4.2.1玻璃板组装

将制好的胶板固定于垂直电泳槽上，凹板向内。上下槽中各加入1×TBE缓冲液，至下槽液面约为槽

高的1/3，上槽液面高于凹板玻璃面约1cm。

9.4.2.2清洗胶孔

拔去梳子，冲洗胶孔，赶走底层气泡和杂质。

9.4.2.3上样

在10μLPCR产物中加入2μL6×loadingbuffer，用微量移液器上样，每孔加入2μLPCR扩增产

物；同时，在两侧样品孔中加入20bpDNALadder分子量标记。

9.4.2.4电泳

电压为200V，根据指示剂位置调整时间，至青蓝色的二甲苯青指示剂到达胶板的2/3处，停止电泳，

电泳时间约2h。

9.4.3银染显色

3

DB37/T3801—2019

9.4.3.1水洗

电泳结束后，分开两块玻璃板取出凝胶，用水漂洗10s～20s，重复2次。

9.4.3.2银染

转移至400mL0.1%AgNO3溶液中，在摇