DB13/T 1767-2013 苹果品种 DNA 指纹鉴定

ICS65.020.20

B05

DB13

河北省地方标准

DB13/T1767—2013

苹果品种DNA指纹鉴定

2013-09-05发布2013-09-30实施

河北省质量技术监督局发布

DB13/T1767—2013

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由河北省林业厅提出。

本标准起草单位：河北农业大学。

本标准主要起草人：刘兴菊、杨敏生、梁海永、张军、左立辉、李雪雁、姚伟明、杨立华、韩志校

魏姗姗、甄红伟、王瑞霞。

I

DB13/T1767—2013

苹果品种DNA指纹鉴定

1范围

本标准规定了苹果品种DNA指纹鉴定的方法及判定标准。

本标准适用于苹果品种鉴定及河北省苹果品种DNA指纹库的建立。

2原理

不同苹果品种由于遗传组成不同，基因组DNA中简单重复序列的重复次数有差异，这种差异可经过

PCR扩增、电泳分离、显色程序绘制的DNA指纹图谱加以区分，从而对不同品种进行鉴定。从苹果幼苗、

叶片等组织中提取总DNA，利用SSR引物对位于不同染色体上的SSR位点进行PCR扩增，不同碱基长度的PCR

扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离（或通过DNA分析仪、测序仪进行分离），并通过染色显示DNA

指纹谱带类型。

3仪器设备及试剂

苹果品种DNA指纹鉴定所需仪器设备及试剂名单见附录A。

4溶液配制

苹果品种DNA指纹鉴定相关溶液配制方法见附录B。

5鉴定方法

5.1样品准备

5.1.1取样量

每份送检样品至少检测3个个体，每个个体至少1g，对一致性差的样品应至少检测5个个体。

5.1.2品种比较方式

a)成对品种的比较

送检样品提供两份，一份为待检品种，一份为对照品种。将待检品种与对照品种直接进行成对比

较。杂交后代需提供母本与父本的样品。

b)品种与DNA指纹库入库品种的比较

送检样品可提供一份。将待检样品与DNA指纹库所有入库品种的指纹进行比较，筛选出指纹最相

似或相同的品种作为待检品种的近似品种，然后将待检品种与近似品种直接进行成对比较。

5.2DNA提取

1

DB13/T1767—2013

5.2.1宜采用改良的CTAB法。取200mg干净叶片置入1.5mL离心管中，加入500μLDNA提取液研磨碎，

并加1mL洗涤液及30μLβ-巯基乙醇，充分摇匀后置冰上5min，于4℃，12000g离心8min后，洗涤

一次，弃上清，再加700μL预热的CTAB缓冲液,充分混匀后，于65℃水浴60min，其间颠倒几次。然

后于室温冷却4min～5min，取上清,加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1),混匀抽提，室温静置5min，

于室温12000g离心8min。上清液移于一新的1.5mL离心管中，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，充

分混匀后室温静置5min，室温12000g离心8min，取上清，重复加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，

取上清加入等体积氯仿抽提一次，取上清液，加入2倍体积的无水乙醇(-20℃)，轻轻混匀后在-20℃沉

淀30分钟以上，12000g离心10min，将所得沉淀风干后溶于100μL水中，置4℃冰箱备用。

5.2.2其它保证DNA质量的方法也可采用，应用前需要通过微量紫外分光光度计进行DNA质量与浓度

检测。

5.3PCR扩增

5.3.1SSR扩增

基本核心引物名单见附录C。

5.3.2反应体系

反应液体积为20μL，组分配制应符合表1的规定（或按比例减少至10μL）。

表1PCR反应体系

反应组分原浓度终浓度反应体积μL

ddH2O13.35

10×buffer10×1×2

MgCl225mmol/L2.5mmol/L2

dNTP2.5mmol/L0.15mmol/L1.2

Taq酶5U/μL1U0.2

引物20μmol/L0.25μmol/L0.25

DNA30~50ng/μL1.5~2.5ng/μL1

5.3.3反应程序

94℃预变性5min；94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s,共30个循环；72℃延伸7min，4℃保

存。

5.4变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

5.4.1清洗玻璃板

用自来水沾洗涤灵将玻璃板反复擦洗干净，双蒸水擦洗两遍，95%乙醇擦洗两遍，干燥。在长板上

涂上0.5mL亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5mL剥离硅烷工作液。操作过程中防止两块玻璃板互

相污染。

5.4.2组装电泳板

待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，并用水平仪调平。

2

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5.4.3灌胶

在100mL4.5%PAGE胶中加入TEMED和25%过硫酸铵各100μL，迅速混匀后灌胶。待胶流动到下部，

在上部轻轻插入梳子，使其聚合至少lh以上。灌胶过程中防止出现气泡。

5.4.4预电泳

在正极槽中加入1×TBE缓冲液600mL，在负极槽(上槽)加入预热至65℃的I×TBE缓冲液600mL，拔

出梳子。90W恒功率预电泳10min~20min。

5.4.5变性

在20μLPCR样品中加入4μL6×加样缓冲液，混匀后，在PCR仪上运行变性程序:95℃变性5min，4℃

冷却10min以上。

5.4.6电泳

用移液器吹吸加样槽，清除气泡和杂质，插入样品梳子。每一个加样孔点入5μL样品。80W恒功率电

泳至上部的指示带(二甲苯青)到达胶板的中部(约40min)。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，凝胶会

紧贴在长板上。

5.5银染

5.5.1银染流程图