DB32/T 4539-2023 淡水生物环境DNA监测技术方法

ICS13.020

CCSZ06

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DB32/T4539—2023

淡水生物环境DNA监测技术方法

TechnicalmethodforenvironmentalDNAmonitoringof

freshwaterorganisms

2023⁃09⁃22发布2023⁃10⁃22实施

江苏省市场监督管理局发布

中国标准出版社出版

DB32/T4539—2023

目次

前言……………………………Ⅲ

1范围…………………………1

2规范性引用文件……………1

3术语和定义…………………1

4监测点位布设………………3

5监测频次与时间……………4

6试剂和材料…………………4

7仪器和设备…………………5

8环境DNA宏条形码监测内容和方法………………………5

9质量控制与质量保证………………………9

10废弃物处理………………10

附录A（资料性）环境DNA固定剂…………11

附录B（资料性）常用淡水生物DNA条形码扩增引物信息……………12

附录C（规范性）淡水生物DNA条形码构建方法…………14

附录D（资料性）生物统计表………………17

附录E（规范性）野外质量控制与保证……………………18

附录F（规范性）实验室质量控制与保证…………………19

参考文献………………………21

Ⅰ

DB32/T4539—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由江苏省生态环境厅提出并归口。

本文件起草单位：江苏省环境监测中心、南京大学。

本文件主要起草人：张咏、张效伟、杨雅楠、杨江华、蔡琨、王晨波、吕学研、李婧慧、张丽娟、钟文军、

侍昊、朱晨、毛成责、卜亚谦、范帆。

Ⅲ

DB32/T4539—2023

淡水生物环境DNA监测技术方法

1范围

本文件规定了利用环境DNA技术监测淡水生物的采样、试剂和材料、仪器和设备、监测内容和步

骤，以及质量控制与保证。

本文件适用于生态环境监测领域湖泊、水库、溪流、河流、河口区等水域浮游植物、浮游动物、着生藻

类、大型底栖无脊椎动物和鱼类等淡水生物物种组成及相对丰度的监测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文

件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T20001.4标准编写规则第4部分：试验方法标准

GB/T29859生物信息学术语

GB/T30989高通量基因测序技术规程

GB/T34265Sanger法测序技术指南

GB/T35890高通量测序数据序列格式规范

GB/T37874核酸提取纯化方法评价通则

GB/T40226环境微生物宏基因组检测高通量测序法

HJ91.2地表水环境质量监测技术规范

HJ494水质采样技术指导

HJ710.7生物多样性观测技术导则内陆水域鱼类

HJ710.8生物多样性观测技术导则淡水底栖大型无脊椎动物

HJ1216水质浮游植物的测定0.1ml计数框⁃显微镜计数法

HJ1295水生态监测技术指南河流水生生物监测与评价（试行）

HJ1296水生态监测技术指南湖泊和水库水生生物监测与评价（试行）

SC/T9402淡水浮游生物调查技术规范

SN/T4835实验室生物废弃物管理要求

DB21/T2777海洋浮游微藻分离和筛选技术规程

DB32/T4178河流水生态监测规范

3术语和定义

GB/T20001.4、GB/T29859和GB/T30989界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

3.1

淡水生物freshwaterorganisms

生活在各类淡水生境中的生物。

1

DB32/T4539—2023

注：主要的淡水生物类群包括浮游植物、浮游动物、大型底栖无脊椎动物和鱼类等。

3.2

环境DNAenvironmentalDNA；eDNA

环境介质（水、土壤、沉积物、生物膜、空气等）或混合生物组织中存在的脱氧核糖核酸（DNA）等生物

遗传物质。

3.3

DNA条形码DNAbarcode

生物体细胞核或者细胞器中能够代表该物种的、有足够变异的、易扩增的短DNA序列，可用于物种

的识别和鉴定。

[来源：SN/T4278—2015，3.1，有修改]

3.4

引物primer

在DNA复制过程中，结合于模板链上并提供DNA合成起点，具有一定长度和顺序的寡核苷酸链。

3.5

聚合酶链式反应polymerasechainreaction；PCR

一种体外酶促合成特异DNA片段的分子技术，由高温变性、低温退火及适温延伸等组成一个周期，

循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便省时等特点。

3.6

Sanger测序Sangersequencing

用于基因测序的双脱氧末端终止法，在链延伸过程中利用荧光标记双脱氧碱基随机阻断，产生以

A/T/G/C结束的四组不同长度的核苷酸链，通过读取荧光信号实现对核酸碱基序列信息的读取。

3.7

遗传距离geneticdistance

群或分类单元间的遗传差异程度，可以通过遗传标记如DNA条形码的序列差异来表示。

3.8

高通量测序high⁃throughputsequencing

区别于传统Sanger（双脱氧链末端终止法）测序，能够一次并行对大量核酸分子进行平行序列测定

的技术。

[来源：GB/T30989—2014，3.19，有修改]

3.9

16S核糖体DNA16SribosomalDNA；16SrDNA

原核生物编码核糖体小亚基rRNA的DNA序列。

3.10

18S核糖体DNA18SribosomalDNA；18SrDNA

真核生物编码核糖体小亚基rRNA的DNA序列。

3.11

线粒体12S核糖体DNAmitochondrial12SribosomalDNA；Mt12SrDNA

后生动物线粒体编码12SrRNA的DNA序列。

3.12

线粒体细胞色素c氧化酶ImitochondrialcytochromecoxidaseI；COI

后生动物线粒体编码细胞色素c氧化酶I的DNA序列。

3.13

DNA宏条形码DNAmetabarcoding

利用高通量测序获取环境DNA中特定的DNA片段，根据DNA序列差异识别物种，获取物种组成

2

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和群落结构。

3.14

标签tag

通过PCR或文库准备过程中为每个样品添加一个短序列的核苷酸碱基对，允许多个样品在一个高

通量测序运行中被汇集。

注：这个序列对于同一个运行中的每个样本都是不同的，并使序列能够在测序后分配回它们来自的样本。

3.15

序列相似性sequencesimilarity

反映序列间相似程度的数值，即序列间相同DNA碱基数目所占的比例。

注：一般以百分数表示。

[来源：SN/T4278—2015，3.8，有修改]

3.16

序列相似性阈值cutoffvalueofsequencesimilarity

判定两条DNA序列是否为同一分类单元的最小序列相似值。

3.17

扩增序列变体ampliconsequencevariants；ASV

DNA宏条形码技术中，通过生物信息学剔除PCR扩增和测序产生的错误序列后形成的独特DNA

序列，即任意两条序列间至少有一个碱基存在差异。

3.18

操作分类单元operationaltaxonomicunit；OTU

DNA宏条形码测序数据按照一定的序列相似性阈值进行聚类，获得的用于表征物种的分子水平分

类单元。

3.19

相对丰度relativeabundance

样品中分配到某一分类单元的序列数占该样品序列总数的比例。

[来源：GB/T40226—2021，3.2，有修改]

3.20

阴性质控样本negativecontrolsample

确定不含特定物种或者所有物种的样本（例如无菌水），与待测样本同步试验，用于判断待测样本是

否被污染。

3.21

阳性质控样本positivecontrolsample

已确定物种组成的样本，与待测样本同步试验，用于判断测序结果是否可靠。

4监测点位布设

4.1通则

按照HJ91.2设置环境DNA采样点位，应遵循连续性、一致性、代表性和可行性原则。结合环境

DNA的时空分布特征，综合考虑监测类群的生态和生活史特征、水体类型、大小、深度、分层、连通性、基

质、温度、水文和水化学等因素的影响。

注：生活污水中可能含有残留的生物DNA，采样位点布设要尽量避免污水排放渠和污水处理厂，并详实记录。

3

DB32/T4539—2023

4.2溪流、河流点位布设

按照HJ1295的规定设置监测断面，每个断面设置不少于3个代表性点位。在缓慢流动的低地溪流

和河流中，宜间隔1km设置采样点。在快速流动的高山溪流和河流中，采样位点宜间隔10km以上。

应详实记录河流的地形特征（如地形、河岸结构、河床沉积物、人工改造等）、流速、水温、pH值等影响环境

DNA扩散的因素。

4.3湖泊、水库监测点位布设

按照HJ1296的规定设置监测点位，大型湖泊应适当增加监测点位。湖库构成湖库群，当对区域湖

库作整体监测时，可适当减少单个湖库的监测点位。宜设置湖库监测点位周边100m的范围内为采样区

域。深水型湖泊宜间隔5m深度分层采样。

5监测频次与时间

5.1监测频次

综合考虑水域环境条件、生物类群的时空分布特点、监测目的及人力、费用投入，确定监测频次。可

选择季度或月度开展监测，应避开雨水集中的时间。针对重点关注区域、突发环境问题或其他条件下，可

开展更高频次的监测。

5.2监测时间

采样时间宜综合考虑靶向监测类群的生态特征和生活史及水体类型。例如：湖泊、水库，宜考虑生物

类群的季节性分层；溪流、河流，宜考虑迁移物种的分布模式（如鱼类洄游）。

6试剂和材料

6.1超纯水。

6.2分析纯无水乙醇。

6.3环境DNA固定剂，可参考附录A。

6.4DNA提取试剂盒或CTAB法提取DNA所用到的试剂。

6.5PCR扩增试剂：用于特异性片段PCR扩增，通常包含缓冲液、扩增酶等。

6.6PCR扩增引物：可参考附录B。

6.7PCR产物纯化试剂盒：用于PCR产物纯化。

6.8DNA浓度测定试剂：用于DNA浓度测定，主要成分包括缓冲液和染色剂。

6.9凝胶电泳相关试剂：用于PCR产物凝胶电泳检测，通常包含琼脂糖、电泳缓冲液（TAE）、片段大小

标记。

6.10文库构建试剂：用于样品的基因文库构建，试剂盒内至少应包含末端修复酶、测序接头、DNA连接

酶、缓冲液。

6.11高通量测序试剂：用于对测序文库进行高通量基因测序，试剂盒内至少应包含测序引物、测序反应

酶、缓冲液。

6.12无菌采样瓶或采样袋：1L及以上规格。

6.13无菌微孔滤膜：0.22µm、0.45µm、1.2µm和5µm等。

6.14无菌镊子。

4

DB32/T4539—2023

6.15无菌离心管：1.5mL、2mL、10mL，无DNA和生物残留。

6.16冻存管：5mL，无DNA和生物残留。

6.17枪头：10µL、200µL、1000µL和5mL等，无DNA和生物残留。

6.18PCR管、96孔板等类似的PCR反应容器：无DNA和生物残留。

6.19无菌手套。

7仪器和设备

7.1恒温水浴锅。

7.2涡旋振荡器或均质仪。

7.3冷冻干燥仪。

7.4真空离心浓缩仪。

7.5高速冷冻离心机：离心转速可达13000r/min，温控范围低至4℃。

7.6微量移液器：0.5µL~10µL、20µL~200µL和100µL~1000µL等。

7.7超微量分光光度计：测量体积最小1µL，波长范围包括230nm、260nm和280nm。

7.8PCR仪。

7.9电子天平。

7.10水平式核酸电泳仪。

7.11凝胶成像分析仪。

7.12高通量测序仪。

7.13高温高压灭菌器：可达到标准要求的121℃、21min灭菌条件。

7.14采水器：2L或5L。

7.15浮游生物网：25号浮游动物网，孔径64µm。

7.16着生藻类采集器具：毛刷、刀片、托盘、洗瓶等。

7.17大型底栖无脊椎动物采集装置：如彼得森采泥器、D型抄网、踢网、索伯网等。

7.18水样抽滤设备：具备-91.2kPa以上的真空抽滤设备。

7.19大型底栖无脊椎动物清洗装置：如40目筛网等。

7.20超净工作台。

7.21低温存储设备：普通冰箱、低温冰箱和超低温冰箱。

7.22液氮罐。

7.23工作站：运行内存不低于16GB，硬盘存储不低于1TB，处理器不低于8核。

7.24高通量测序数据质量控制和分析软件。

8环境DNA宏条形码监测内容和方法

8.1环境DNA宏条形码监测内容

环境DNA宏条形码监测包括环境DNA样品采集、环境DNA提取、宏条形码扩增与测序、生物信

息学分析、生物统计表和质量控制与质量保证等过程（见图1）。

5

DB32/T4539—2023

图1环境DNA宏条形码监测技术流程

8.2环境DNA样品采集

8.2.1通则

根据监测的生物类群，按照表1选择合适的环境DNA采集方法，每个位点采集3个生物重复样品。

表1不同生物类群的环境DNA采样介质

生物类群水样沉积物生物膜混合生物组织

浮游植物++++

着生藻类+++++

浮游动物++++++a

大型底栖无脊椎动物+++++++b

鱼类++++

注：+表示可用，++表示较多采用，+++表示最为常用。

a浮游动物主要通过浮游生物网收集组织DNA。

b大型底栖无脊椎动物主要通过采集沉积物中底栖动物组织，进一步通过乙醇浸提法获取组织DNA。

8.2.2水样

水样采集按照HJ494的规定执行，采样体积不宜小于1L。浮游植物监测的水样体积宜为1L，底

栖动物和鱼类监测的水样体积宜为3L。现场过滤至一定孔径（一般为0.45µm）的滤膜上，高泥沙水样，

应低温（4℃或冰袋保存）静置分离悬浮颗粒物，再过滤。生物密度较高的水体（如处于藻华爆发期），可

将水样等体积分开过滤至多张（1~5）滤膜作为子样本。野外干冰、液氮或-20℃保存，实验室-20℃以

下保存；或者加入附录A推荐的固定剂，常温保存。

8.2.3沉积物样品

按照HJ494的规定采集