YY/T 1805.3-2022 组织工程医疗器械产品 胶原蛋白 第3部分：基于特征多肽测定的胶原蛋白含量检测 液相色谱-质谱法

ICS1104030

CCSC.30.

中华人民共和国医药行业标准

YY/T18053—2022

.

组织工程医疗器械产品胶原蛋白

第3部分基于特征多肽测定的胶原蛋白

:

含量检测液相色谱-质谱法

Tissueengineeringmedicaldeviceproducts—Collagenprotein—

Part3uantificationofcollaenbasedonmarkeretidedetection—

:Qgpp

Liquidchromatography-massspectrometry

2022-01-13发布2022-08-01实施

国家药品监督管理局发布

YY/T18053—2022

.

目次

前言

…………………………Ⅰ

引言

…………………………Ⅱ

范围

1………………………1

规范性引用文件

2…………………………1

术语和定义

3………………1

概述

4………………………1

试剂及其配制

5……………2

仪器和设备

6………………3

检测方法

7…………………3

结果计算

8…………………5

附录规范性牛型胶原蛋白特征多肽含量检测

A()Ⅰ…………………6

附录规范性牛型胶原蛋白特征多肽含量检测

B()Ⅱ…………………9

附录规范性猪型胶原蛋白特征多肽含量检测

C()Ⅰ…………………12

参考文献

……………………15

YY/T18053—2022

.

前言

本文件按照标准化工作导则第部分标准化文件的结构和起草规则的规定

GB/T1.1—2020《1:》

起草

。

本文件是组织工程医疗器械产品胶原蛋白的第部分已经发布了

YY/T1805《》3。YY/T1805

以下部分

:

第部分型胶原蛋白分子量检测十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法

———2:Ⅰ;

第部分基于特征多肽测定的胶原蛋白含量检测液相色谱质谱法

———3:-。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别专利的责任

。。

本文件由国家药品监督管理局提出

。

本文件由全国外科植入物和矫形器械标准化技术委员会组织工程医疗器械产品分技术委员会

归口

(SAC/TC110/SC3)。

本文件起草单位中国科学院过程工程研究所中国食品药品检定研究院岛津企业管理中国有

:、、()

限公司国科卓越北京医药科技研究有限公司

、()。

本文件主要起草人张贵锋高建萍张天宏李晓东冀峰李敬来范行良冯倩倩张乐徐丽明

:、、、、、、、、、。

Ⅰ

YY/T18053—2022

.

引言

用于组织工程医疗器械产品的胶原蛋白类材料包括组织提取的胶原蛋白和基因重组的胶原蛋白

。

胶原蛋白被广泛应用于各种医疗器械产品的研发和产品制备胶原蛋白类材料具有不同的特性如分

。,:

子量纯度种属型别差异三螺旋结构细胞黏附特性等这些性能直接关系着胶原蛋白的质量和使用

、、、、、,

性能组织工程医疗器械产品胶原蛋白旨在建立胶原蛋白某些特殊性能的检测和表征

。YY/T1805《》

方法拟由个部分构成

,4。

第部分术语和定义目的在于给出包括组织提取的胶原蛋白和基因重组胶原蛋白的各种

———1:。

术语和定义

。

第部分型胶原蛋白分子量检测十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法目的在于提

———2:Ⅰ。

供可用于胶原蛋白分子量检测的方法

。

第部分基于特征多肽测定的胶原蛋白含量检测液相色谱质谱法目的在于给出基于特

———3:-。

征多肽定量测定间接地反映胶原蛋白含量的液相色谱质谱检测方法该方法也可用于种属

,-。

来源和型别的鉴别

。

第部分胶原蛋白螺旋结构表征方法目的在于建立不同参数和指标的胶原蛋白结构分析

———4:。

和三螺旋结构表征方法用于评价其三螺旋结构的有无相对含量及其完整性

,、。

胶原蛋白含量的检测目前常用的有羟脯氨酸法通过羟脯氨酸含量的检测来反映胶原蛋白含量

,。

本文件给出的是基于合成特异性胶原蛋白特征多肽对照品利用液相色谱质谱法进行胶原蛋白特征多

,-

肽含量的测定间接地反映胶原蛋白的含量

,。

Ⅱ

YY/T18053—2022

.

组织工程医疗器械产品胶原蛋白

第3部分基于特征多肽测定的胶原蛋白

:

含量检测液相色谱-质谱法

1范围

本文件规定了用液相色谱质谱法测定不同类型胶原蛋白特征多肽含量的方法

-。

本文件适用于组织提取纯化的胶原蛋白及其胶原类产品中不同类型胶原蛋白特征多肽含量的

测定

。

注重组胶原蛋白脱细胞基质经胶原蛋白提取后的样品可参考本方法进行相应的胶原蛋白特征多肽含量测定

:、。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中注日期的引用文

。,

件仅该日期对应的版本适用于本文件不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于

,;,()

本文件

。

分析实验室用水规格和试验方法

GB/T6682

组织工程医疗器械产品型胶原蛋白表征方法

YY/T1453Ⅰ

中华人民共和国药典年版

(2020)

3术语和定义

界定的术语和定义适用于本文件

YY/T1453。

4概述

将胶原蛋白试样溶解加热变性后进行胰蛋白酶酶解释放特征多肽再用液相色谱质谱法测定

,,;-。

以不同类型胶原蛋白特征多肽的保留时间和二级子离子碎片的质荷比进行定性和确证用外标法或内

,

标法进行定量

。

用合成的不同类型胶原蛋白特征多肽作为标准品实现外标法定量检测用合成的相同特征多肽序

,;

列的同位素标记特征多肽与非同位素标记特征多肽按一定比例混合实现内标法定量检测同位素内

,。

标法有助于改善基质效应对测定准确性的干扰

。

本文件以同位素内标法为例分别给出牛型牛型和猪型胶原蛋白特征多肽含量检测的标准

,Ⅰ、ⅡⅠ

操作规程和要求其中牛型胶原蛋白特征多肽含量检测按附录牛型胶原蛋白特征多肽含量检

。,ⅠA,Ⅱ

测按附录猪型胶原蛋白特征多肽含量检测按附录进行测定针对不同动物来源或不同型别的

B,ⅠC。

胶原蛋白也可自行筛选合适的特征多肽经验证后进行定量检测

,。

1

YY/T18053—2022

.

5试剂及其配制

51试剂和对照品

.

所用试剂及对照品要求如下

:

乙腈色谱纯

a),。

胰蛋白酶序列纯

b),。

碳酸氢铵分析纯

c),。

甲酸色谱纯

d),。

胶原蛋白特征多肽对照品检测不同种属及不同类型的胶原蛋白特征多肽含量时需要设计和

e):,

合成相应的种属和或型别特异性的胶原蛋白特征多肽作为定量对照品其设计原则为对

/,。:

不同来源及不同类型的胶原蛋白序列进行多序列比对只在某一特定来源和或特定类

Blast,/

型的胶原蛋白序列中出现的肽段且化学修饰或交联对其丰度没有影响为其特异性的特征多

,,

肽并保证在色谱分离过程中有较高的分离度

,。

注推荐使用国家医药标准物质

:。

同位素标记特征多肽将作为定量用对照品的特征多肽进行同位素标记与定量用特征多肽对

f):,

照品以及待检测样品按一定比例混合通过特征多肽与其同位素内标峰面积的比值对样品中

,

特征多肽进行定量有助于降低或消除基质干扰

,。

52溶液配制

.

所用溶液配制方法如下

:

溶液配制用水应满足中分析实验室用水的要求

GB/T6682。

乙腈水溶液体积比乙腈水为

a)():∶6∶4;

碳酸氢铵溶液精密称定碳酸氢铵加水定容至现用现配

b)0.05mol/L:0.3950g,100mL();

碳酸氢铵溶液精密称定碳酸氢铵加水定容至现用现配

c)0.10mol/L:0.7900g,100mL();

液相色谱流动相

d):

流动相取水置容量瓶中加入甲酸并加水定容至用

1)A:200mL1L,1mL,1L,0.22μm

滤膜过滤后备用

;

流动相取乙腈水溶液置容量瓶中加入甲酸并加乙腈水溶液

2)B:200mL[a)]1L,1mL,

定容至用滤膜过滤后备用

[a)]1L,0.22μm;

特征多肽标准工作溶液配制

e):

特征多肽储备液配制精密称定一定量的胶原蛋白特征多肽最小取样量用

1):(5mg),1mL

碳酸氢铵溶液溶解用碳酸氢铵溶液定容配制成浓度为

0.05mol/L,0.05mol/L,2mg/mL

的标准溶液保存有效期天

,2℃~4℃,7;

同位素标记特征多肽内标储备液配制精密称定一定量的同位素标记胶原蛋白特征多肽

2):

最小取样量用碳酸氢铵溶液溶解转移至容量瓶中用

(5mg),1mL0.05mol/L,10mL,

碳酸氢铵溶液定容配制成浓度为的标准溶液保存有

0.05mol/L,2mg/mL,2℃~4℃,

效期天

7;

取适量的同位素标记特征多肽内标储备液用碳酸氢铵溶液稀释成适当浓度

,0.05mol/L

的同位素内标工作溶液其信号强度应与被测组分相当现用现配

(,);

2

YY/T18053—2022

.

注1特征多肽和同位素标记的特征多肽对照品可以取瓶瓶直接全部溶解配制成相应浓度的储备

:1(20mg/),,

液分装后以下冷冻保存

,-20℃。

注2推荐用纯甲醇配制同位素特征多肽内标储备液和特征多肽储备液以下冷冻保存使用时再用

:,-20℃,

碳酸氢铵溶液稀释

0.05mol/L。

特征多肽标准工作液配制用碳酸氢铵溶液稀释成系列浓度的特征多肽标准

3):0.05mol/L

工作液并与同位素内标标准工作溶液按一定比例混合现用现配制备系列标准样品

,(),,

离心g取上清液置进样瓶中待用

(3000,10min),,;

注3采用外标法时直接用特征多肽标准工作溶液进行测定

:。

注4为防止特征多肽的吸附可在配制储备液或工作液时添加乙腈体积分数同时在样品配制时同样添

: