GB/T 36824-2018 松针红斑病菌检疫鉴定方法

ICS65.020.01

B16

国

中华人民共和国国家标准

GB/T36824-2018

松针红斑病菌检疫鉴定方法

DetectionandidentificationofMycosphαerellαpiniE.Rostrup

2018-09-17发布2019-04-01实施

国家市场监督管理总局峪非

中国国家标准化管理委员会0(..'I(J

GB/T36824-2018

目u昌

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由全同植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出井归口。

本标准起草单位：中华人民共和同安徽归入境检验检疫局。

本标准主要起草人：李云飞、宗凯、姚剑、孙娟娟、华陈意、郑海松、余晓峰、陈雪娇、李刚、王满满、

谢超。

I

GB/T36824-2018

附录C

（规范性附录）

松针红斑病菌的实时荧光PCR检测方法

C.1DNA提取

C.1.1将分离培养物置于研钵用液氮冷冻后磨碎，称取50mg~100mg于1.5mL的灭菌离心管中，加

入700µLCTAB缓冲液，振荡混匀，置于65℃泪浴60min-90min，期｜可不断混匀。

C.1.2加入7001.1.L酣：三氯甲烧：异戊醇（25:24:1），振荡均匀，12000r/min，离心15min。

C.1.3取上清液放入另一1.5mL新管中，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒3次～5次，室泪下放置1h。

C.1.412000r/min离心10min，弃去上清液。

C.1.5加入400,uL70%乙醇榕液洗涤，12000r/min离心1min，弃上清液，将离心管室掘下干燥

15min。

C.1.6加入50,uL~100µLTE或ddH20，充分溶解后置于一20℃冰箱保存备用。

注：也可使用试剂盒进行DN八提取，具体方法按照试剂盒说明书操作。

C.2实时荧光PCR检测

C.2.1引物探针序列

松针红斑病菌实时荧光PCR方法鉴定引物探剖序列见表C.L

表C.1引物序列

习｜物和探针名称序列

MPF5’-CCGCCJ\GTGCTTC八ACACT-3’

MPR5’－TGGGA.GGC八GG八TGJ\CG八T-3’

MPP5’-FAM-TGCCGGCATCC八CGC八GC-TJ\MRA-3’

C.2.2检测体系

按照表C.2配置反应体系，泪合均匀后放入荧光定量PCR仪扩增。每个样品设置两个平行，以松

专｜红斑病菌DNA为阳性对照，其他真菌DNA为阴性对照，ddH20为空向对照。

表C.2检测体系

试剂名称力｜｜入PCR反应体系的体积／µL

实时荧光PCR预混液（2×）10

正l•J引物00µmol/L)l

反｜同引物00µmol/L)l

t为：针00µmol/L)0.5

9

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表C.2（续）

试齐1］名称力｜｜人PCR反应休系的休积／µL

D:-1八模极2

ddH205.5

20

总计

注：反应体系巾备试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。

C.2.3反应条件

95℃30s;95℃15s,60℃25s，共40个循环。

C.3结果判定

C.3.1对照结果

阳性对照：检测Ct值小于或等于35;

阴性对照：检测Ct值大于或等于40;

空白对照：检~IJCt值大于或等于40;

上述指标有一项不符合，应重做实时荧光PCR扩增。

C.3.2检测结果的判定

样品Ct值大于35，判定该样品为阴性。

样品Ct值小于或等于35，判定该样品为阳性。

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参考文献

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