GB/T 28979-2012 欧芹壳针孢检疫鉴定方法

ICS65.020.01——_—

B16G目

中华人民共和国国彖标准

GB/T28979—2012

欧芹壳针抱检疫鉴定方法

DetectionandidentificationofSeptoriapetroselini

2012-12-31发布2013-06-01实施

GB/T28979—2012

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心。

本标准主要起草人:林石明、廖富荣、陈青、黄蓬英、陈红运、王宏毅、吴媛。

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GB/T28979—2012

欧芹壳针砲检疫鉴定方法

1范围

本标准规定了欧芹壳针抱的检测和鉴定方法。

本标准适用于欧芹属种子、苗木及其产品中欧芹壳针抱的检测和鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T18085—2000植物检疫小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法

SN/T1809进出境植物种子检疫规程

SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样

3欧芹壳针砲基本信息

拉丁学名：Seploriapelroselini(Libert)Desmazieres

中文名称：欧芹壳针抱

属真菌界(Fungi)，无性真菌门(Anamorphicfungi)，未分目(曾归为球壳抱目Sphaeropsidales),未

分科(曾归为球壳抱科Sphaeropsidaceae)，壳针抱属(Seploria)0至今尚未发现其有性阶段。

欧芹壳针抱自然侵染欧芹(Pelroselinumcrispum)和芫荽(Coriandrumsali-uum)，引起欧芹壳针抱

叶斑病。该病菌主要通过感染的种子进行远距离传播，种子是重要的初侵染源。

欧芹壳针抱的其他相关信息参见附录A。

4方法原理

本标准通过分离培养，根据菌落形态特征，病原菌无性世代的分生抱子器、分生范子梗和分生抱子

的形态特征，结合病菌所引起的主要危害症状，对该病原进行鉴定。

5主要试剂、仪器设备和用具

5.1主要试剂

次氯酸钠，蔗糖，甘油，琼脂，酒精等。

5.2仪器设备

超净T作台，高压灭菌锅，光照培养箱，生物显微镜(20X〜400X)等。

5.3用具

白瓷盘，培养皿，酒精灯，吸水纸，载玻片，盖玻片，刀片，手术剪，银子，尖头银子,刷子，pH计，血球

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GB/T28979—2012

计数板，塑料袋，离心管等。

6抽样与检查

按SN/T1809或SN/T2122规定的抽样方法进行抽样检查。

检查种子、苗木及其产品是否有病斑、小黑点（分生抱子器）等（参见附录A）。若有小黑点，直接切

片在显微镜下检查。受感染的叶片初为黄色小斑，随后变成浅黄色至黄褐色，最后为褐色的病斑。病斑

边缘颜色稍深，为坏死圈。病斑圆形至长圆球形，或不规则，平均3mm〜8mm,最大的直径约13mm,

边缘具窄的褐色的坏死线。在叶柄上为卵圆形、暗褐色的小病斑。叶面上病斑产生黑色小点（即分生抱

子器）。在种子表面具黑色小病斑或小黑点。

7病菌分离

7.1植物组织中病菌的分离

将植物组织用1%的次氯酸钠消毒2min〜5min,用无菌蒸憾水冲洗，在无菌条件下晾干，放置在

PDA培养基上，于20°C〜25°C下培养3d~5d后，挑取菌落边缘菌丝进行纯化。

7.2种子中病菌的分离

7.2.1洗涤检查

称取50g或适量的种子，加无菌水100mL,在振荡器中振荡5min,取洗涤液在1000r/min离心

3min,弃上清液，在沉淀中加入适量（约1mL）的席尔氏液（配制方法见GB/T18085—2000的附录A）

悬浮，取1滴（约50pL）的悬浮液在显微镜下（20X—400X）检查。

7.2.2分离培养

检查异常的种子,挑取表面具有小黑点的种子，或随机挑取种子，每份样品至少检测400粒种子。

用蒸谓水将吸水纸充分湿润（避免产生多余的水），种子均匀置于吸水纸或PDA培养基上（如直径9cm

的培养皿约25粒/皿），加盖后，在20°C〜22°C，在12h紫外光和12h黑暗下交替培养。或者先在

20°C下培养24h,而后于一20°C冷冻24h05d~7d后观察培养结果，挑取可疑菌落进行分离纯化。

8病菌鉴定

&1形态特征

&1.1在PDA培养基上（见附录B）,菌落糠秫状，呈暗褐色（参见图A.3）。从病组织或分离纯化所得

的菌落挑取的分生抱子器，在立体显微镜下进行形态观察和切片（最好能够从孔口处切开），根据分生抱

子器、分生抱子梗和分生抱子的形态特征进行鉴定。

&1.2分生抱子器埋生于表皮下或稍微突出，单室，球形至近球形，有些较扁，黄色至黑褐色，直径

55ym〜200卩m；具近圆形至椭圆形孔口，直径20卩m〜40/am。分生抱子器壁由多角形的厚壁细胞所

组成，厚壁细胞直径为3pm〜5“n,黄色至褐色。分生抱子梗短，瓶梗形，无色透明，从分生抱子器的

内壁伸出，产抱方式为全壁芽生合轴式。分生抱子具0〜4个真隔膜，一般为1〜3个隔膜，未成熟的可

能没有隔膜，无色透明，线状或近圆柱形，（1.0卩m〜1.5ym）X（22卩m〜51卩m），长宽比例大于10,通

常稍微弯曲，基部钝圆而顶部渐尖。参见图A.4〜图A.6。

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GB/T28979—2012

&2致病性测定

&2.1接种体制备

刮取在PDA培养3d的可疑菌落的分生抱子，用无菌水配制成IO：CFU/mL~106CFU/mL抱子

悬浮液。

&2.2接种试验

将欧芹种子播种于小盆钵中，每盆播种5〜8粒种子，生长5周〜7周，备用。用刷子轻扫欧芹幼苗

叶片进行创伤，将抱子悬浮液喷雾接种于欧芹的叶片上，每盆接种5株，重复二次。用无菌水作空白对

照。如可能，采用欧芹壳针抱已知菌株作阳性对照。接种后用干净的塑料袋包扎封口，在饱和湿度，于

20°C下黑暗中培养48h后，去掉塑料袋，在65%〜70%的相对湿度下，移入培养箱,20°C〜25°C下黑

暗中培养；注意观察,一般在14d后就产生典型的症状。

9结果判定与样品保存

9.1结果判定

9.1.1未分离到可疑菌落

病菌分离培养7d后，仍未产生可疑菌落，则未检出。

9.1.2分离到可疑