NY/T 555-2002 动物产品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测方法

ICS11.220

s41

中华人民共和国农业行业标准

NY/T555-2002

动物产品中大肠菌群、粪大肠菌群

和大肠杆菌的检测方法

Detectionmethodsforcoliformgroup,faecalcoliformgroup，

coliformbacteriainanimalproducts

2002一08一27发布2002门2一01实施

中华人民共和国农业部发布

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NY/T555-2002

前言

大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌是食品卫生的三项重要的卫生指标。当前国际上采用的方法有美

国公职分析化学家协会(AOAC)方法及日本人介绍的煌绿乳糖胆盐肉汤((BGLB)和EC试管发酵法。为

满足要求，依照日本采用的BGLB和EC试管发酵法并进行适当改进，建立了本检测方法。本方法用

BGLB发酵管检测大肠菌群并计算最大可能数(MPN)值，用EC肉汤发醉管检测粪大肠菌群并计算

MPN值，在检测粪大肠菌群的基础上通过生化鉴定检测大肠杆菌并计算MPN值，鉴定中省去了革兰

氏染色。这些重要改进缩短了检验时间，简化了操作程序，而且经对比试验证明结果可靠，适合于动物产

品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测。

本标准的附录A是规范性附录，附录B是资料性附录。

本标准由农业部畜牧兽医局提出。

本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。

本标准起草单位:天津动植物检疫局。

本标准主要起草人:秦贞奎、张碧波、侯艳梅、杨金良、薛振源。

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动物产品中大肠菌群、粪大肠菌群

和大肠杆菌的检测方法

1范围

本标准规定了动物产品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测方法。

本标准适用于动物产品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本标准

2.1

大肠菌群coliforms;coliformgronp

一群能分解乳糖产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆茵。

2.2

粪大肠菌群faecalcoliforms;faecalcoliformsgronp

44.5C发酵乳糖产气的一群细菌，是用来表示来源于粪便的大肠菌群。

2.3

大肠杆菌escherichiacoli;coliformbacteria

符合大肠菌群和粪大肠菌群定义，用IMVic(靛基质、甲基红、维培和西蒙氏柠檬酸盐)生化试验进

一步鉴定，四种生化反应结果依次为++一一和一+一一的细菌。

2.4

最大可能数mostprobablenumber,MPN

采用多次稀释方法所求得的最近似数，是通过概率计算出来的。

2.5IMViC

靛基质试验、甲基红试验、维培(VP)试验和构椽酸盐利用试验的缩写。

3检测方法

3.飞材料准备

3.1.1仪器

吸管，恒温水浴箱，培养箱，匀浆器，100m1.,200mL和500mL三角瓶及广口瓶，直径5mm的玻

璃珠。

3.1.2培养基及试剂

配制方法见附录A(规范性附录)。

31.2.1煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB),配制方法见第A.1章。

3.1.2.2EC肉汤，配制方法见第A.2章。

3门.2.3伊红美蓝琼脂(EMB)，配制方法见第A.3章。

3.1.2.4甲基红一维培(MR-VP)培养基，配制方法见第A.4章。

3.1.2.5西蒙氏柠檬酸盐培养基，配制方法见第A.5章。

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3.1.2.6靛基质(引“噪)试验培养基，配制方法见第A.6章。

3.1.2.7科瓦克(Kovacs)氏靛基质试剂，配制方法见第A.7章

3门.2.8甲基红指示剂，配制方法见第A.8章。

3.1.29维培(VP)试剂，配制方法见第A.9章。

3.2检测程序

本标准的检测程序见图1.

，图1检测程序流程图

3.3样品制备

3.3.1无菌操作从动物产品中采取有代裹性的样品

如有包装则用75%乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检测，应将冷冻样品置于一15℃冰箱保

存。非冷冻而易腐的样品，应置于4℃冰箱保存。检测前冷冻样品可于2℃一一5℃下在18h内，或于

45℃下在15min内解冻。

13.2不同样品匀浆液的制备

3.3.2.1液体样品:以无菌吸管取样25mL加人到装有225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶(瓶内预

置适当数量的玻璃珠)内，制成1:10的样品匀浆。

3.3-2.2固体和半固体样品:以无菌操作取样25'g，加人到装有225mL灭菌生理盐水的灭菌匀浆器

内，于8000r/min均浆2min，制成1:10样品匀浆(也可用灭菌乳钵研磨的方式代替)。

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3.3.2.3样品稀释液的制备:根据样品污染情况，用灭菌生理盐水将样品匀浆制成一系列十倍递增的

样品稀释液(通常采用10-',10-1和10-’稀释)。从制备样品匀浆至稀释完毕，全过程不得超过15mine

3.4大肠菌群的测定

3.4.1大肠菌群MPN值的测定

3.4.1.1每个样品通常选用10-1,10-2和10-3三个连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管

BGLB(见第A.1章)，每管接种1mL，每接种一个稀释度换一支无菌吸管。

3.4.1.2将接种管置于((36士1)℃培养24h,

3.4.1.3观察试管的产气情况:检查管内是否有气泡产生，并记录24h内产气的BGLB管数。如所有

培养管均未产气，则报告大肠菌群阴性;如有产气管，进一步试验证实。

3.4.2大肠菌群的证实试验

3.4.2.1将所有产气管中的培养物用接种环接种到伊红美蓝琼脂平板，(36士1)℃培养24h,

3.4.2.2大肠菌群在伊红美蓝琼脂平板上生长，其菌落为有金属光泽、黑紫色或紫色带黑心。

3.4.2.3查有金属光泽、黑紫色或紫色带黑心菌落的BGLB产气管数及其稀释倍数。

3.4-2.4结果报告:按3.4.2.3检查结果，查MPN检索表(见附录B)，报告大肠菌群的MPN/g(mL)

值。

3.5粪大肠菌群测定

3.5.1粪大肠菌群MPN值的侧定

3.5.1.1每个样品通常选用10-,10“和i0-，三个连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管

EC肉汤，每管接种1mLe

15.1.2将所有接种的EC肉汤管于30min内置于温度为(44.5士。.5)℃的带盖水浴箱内，培养((24

士2)h。水浴箱的水面应高于肉汤培养基液面。用44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的大肠

杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。

3.5.1.3记录EC管的产气情况。EC肉汤管都不产气为粪大肠菌群阴性，产气为粪大肠菌群阳性。将

产气管作证实试验。

3.5.2证实试验

3.5.2.1将产气管接种伊红美蓝平板在((36士1)"C培养24h.

3.5-2.2查有金属光泽、紫色带黑心菌落的EC产气管数及其稀释倍数。

3.5-2.3结果报告:按3.5.2.2结果，查MPN检索表(见附录B)。报告粪大肠菌群的MPN/g(mL)值。

3.6大肠杆菌测定

3.6.1培养

将3.5-2.1中伊红美蓝平板上典型大肠杆菌菌落接种到营养琼脂平板，在((36土1)℃培养18h-

24h。每个平板至少挑选2个菌落。

3.6.2生化试验

挑取上述菌落纯培养物接种3.6.3生化培养基和乳糖发酵管，(36士1)0C培养24h后观察结果。

3.6.3大肠杆菌与非大肠杆苗鉴别试验方法

3.6.3.1靛基质试验:

a)滴加Kovacs氏靛基质试剂0.1mL于靛基质试验培养基中混合，静置，观察结果。

b)出现红色环的为反应阳性;出现黄色环的为反应阴性。

3.6-3.2甲基红(MR)试验:

a)滴加甲基红指示剂0.2m1于MR-VP培养基中混合，观察结果。

b)出现红色为阳性反应;出现黄色为阴性反应。

3.6.3.3维培(VP)试验:

滴加VP试剂甲液0.2mL于MR-VP培养基中混匀，再滴加VP试剂乙液。.1mL混匀，静

a)

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置，观察结果。

b)在15min内出现红色的为阳性反应;无颜