GB/T 18636-2002 蓝舌病诊断技术

(;B/,r186362002

前卜J

本标准根据我国近二十年对蓝舌病诊断的研究成果和技术的发展，参考世界动物P.}几组织厂w。山!

OrganizationforAnimallieaIth(#}),OfficeIntentionaldesEpizootic(法).)(工G」标准性文件世《界动物

I1.生组织推荐的诊断力一法和生物制品标准手册))2.1.9条“蓝占病”和澳大利亚动物疫病标雕诊断方法

'"Bluetongue帝而编写的本〔标准引用了GI3/T18089-200A(微量中和试验及病毒分离和鉴定方法》

有关规定力法

俄舌病是由库蝶传播、蓝舌病病毒引起的仗害反当动物的严重传染病。蓝舌病病毒系呼肠孤病毒科

环状病毒属t3群成员、国际已知有24个血清型，在血清学卜与环状病毒属相关病毒有交叉反应:该病

毒主要引起绵羊发病和死亡牛及其他反=1动物常为隐性感染，但川通过媒介昆虫传播本病鉴于该病

的诊断和检疫技术复杂，因此应建立该病的综合诊断技术标准.这是制定本标准的宗旨

本标准规定的方法，分别适用于病At分离鉴定、病原检测、病毒血清'j}1鉴定和抗体检测等不同需要。

木标准的附录A、附录日都是标准的附录，附录C是提示的附录。

本标准山中华人民共和国农业部提出。

本标滩山个国动物检疫标准化技术委员会归CI,

本标准起草单位:云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室、农业部动物检疫所、大津动植物检疫

)1.)

本标准主要起草人:张念祖、杨承谕、李志华、张富强、胡玉玲、张开礼、马洪超、赵祥平、向文彬

中华人民共和国国家标准

蓝舌病诊断技术GB/,r18636-2002

Diagnostictechniquesforbluetongue

1范围

本标准规定J蓝舌病的诊断技术和程序。

本标雕适用于蓝舌病的诊断和检疫。4,5,6章用于病毒分离鉴定和病原检测,7,8章用于病毒的血

清型鉴定，9,10章用于抗体检测。

2引用标准

下列标准所包括的条文.通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均

为有效。所有标准都会被修订.使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。

(B/f180892000蓝舌病微W血清中和试验及病毒分离和鉴定方法

3病毒分离和鉴定

3.1器械和设备

3.1.1%孔组织培养板(平底，简称96孔板)，单道微量加样器(0.51'1一101<L,51,1,-10,11·

401'1一，0p1.200tal一10001'1)及滴头，八道连续加样器(50fl,,100V1_,150uL,20011)及滴头

3门.21(、2oC、一80(冰箱，普通恒温培养箱及二氧化碳培养箱。

3门.3鸡胚开孔器，照蛋箱或鸡胚用灯，组织捣碎器及擦镜纸(高压灭菌备用)。

3.1.4超声波粉碎器，低速离心机，倒置显微镜及荧光显微镜

I2试剂J卜材料

12门肝素抗凝血采血竹

3.2.2细胞:蚊子细胞(C6/36)、仓鼠肾细胞(BHK,)或非洲绿猴肾细胞(Vero)

3.2.3细胞培养液及分散液(按常规配力配制)

3.2.4&ir,病'p-s隆抗体1(8n3B6,7D3n2)o

12.5蓝r-病荧光抗体

12.61()一11l1龄鸡胚。

13病毒分离

I11样品的采集和制备见(:B/"1'18089-2000中8.1。

I12鸡胚接种见(.B门’18089-2000中8.2

I13接种细胞

33.3.1将捣碎的鸡胚肝组织离心，2000r/min,10min，取r.清液为避免不必要的“有传”先‘对待分

离材料进行捕获酶联免疫吸附(ELISA)试验(见第‘章)，将呈阳性的反应材料接种(;6/36细胞，睡份

样.结接两管(瓶)，梅管(瓶)接。.2ml。将接种细胞置于30C温箱培养7d

13.3.2吹打接种的'(6/36细胞，接种于BHK细胞，侮份C6/36接种八管(瓶)BHK，旬管0.2ml，

接种的BIIK细胞ti:于37(环境中，吸附th一hRAI生)竺兰全1夔鲤选竺2缨燮些堕生出现细

中华人民共和国国家质里监督检验检疫总局2002-02-19批准2002-0501实施

GB/7门8636-2002

胞病变C〔I'E)者收获，无细胞病变(CPE)者在BHK细胞育传几代，仍无细胞病变弃之

13.4病毒保存及1_作液的制备

13.4门BHKF.出现细胞病变的病毒悬液JB1ml无‘菌小管分装，作为原始毒，置80C保存。

3.3-4.2川原始毒于BHK.细胞上扩增，分装保存，记为“原始毒+1”

33.4.3“原始毒+11，按3.3.3.2方法增殖，分装、保存，作为贮存毒液

3.3.4.4贮存毒液增殖分装，4C保存，作为工作毒液，用于病毒鉴定

3.4病毒鉴定

鉴定方法见GB月’18089-2000中9.1及本标准4.6

d免疫酶染色(immunoenzymestain)

4门器械和设备

4.1.196孔组织培养板(平底)，单道加样器(0.5VI一10A;l.,5;,l一10川J、魂pl-200u1.,200,;L-

1000Id,)及滴头，八道加样器(50,11100il-150pL.200曰及滴头稀释试}'I用小瓶

4.1.2普通恒温箱(37C),4〔、一20〔冰箱及倒置显微镜

4.2试M#与材料

4.2.1病毒分离获得的未知毒株。

4.2.2仓鼠肾细胞(BHK.)，使用浓度2.5X10，个/ml一3.3X10个m-/l

4.2.3培养液基础培养液/汉克氏液(BHF/HANKS)液十Ioi}tx'1nii清+1丫Ii14A.链霉素液(最低

浓度为100IU或pg/-L,4、保存)

4-2.4蓝舌病单克隆抗体(8A3B6,7D3八2).4C保存，羊(或兔)抗鼠免疫球蛋白G(IgG)辣根过氧化物

酶联结合物。

4.2.5Ig(;浓度1.3mg/mI，在一20C、以下保存。

4.2.68%的福尔马林(即37%-40%甲醛水溶液)

4.2.7溶液配制:磷酸盐缓冲液(pH7.4)+0.05%吐温-20(PBST)

1%明胶PBSTo

底物3氨基一9乙基咔吐(AEC)液配制方法见附录A(标准的附录)。

4.3操作程序

4.3.196孔组织培养板中加待检病毒(3.3.4.4).每个样品I孔，20砂一孔

4.3.2设细胞对照4孔(加细胞生长液20pI/孔)，阳性对照4孔(加已知蓝舌病病毒悬液20ILI/孔)，

阴性对照4孔(加其他环状病毒群成员如鹿流行性出血病病毒20ILI/孔、。

4.3.3每孔加入13HK。细胞悬液180ILL(2.OXI()个/ml,),置37C5%二氧化碳中培养，逐日观察

4.3.4当样品孔出现细胞病变时，每孔加人8%福尔马林200I<1，室温静置10min，移弃福尔马林和细

胞培养液

4.15IHPBST(见附录“、洗涤易次

4.3.6加单克隆抗体(8A3BG+7D3A2;用含1r0明胶的P[BST作1:5稀释)50ICI/孔，放于湿盒中，

37C,0}育90min.

4.3.7用P13ST洗涤5次。

4.3.8加酶结合物(抗鼠1gG辣根过氧化物酶结合物，用含t%明胶的PBST作t:1000稀释)50k1,/

孔，放于湿盒中，37C，反应90mmo

4.19加底物(AEC),41孔1001,1，室温静置30min用倒置显微镜观察

4.4判定

阴性对照、细胞对照不着色，而阳性对照中的感染细胞被染成红棕色时，试验成+Y_样.异t，1'有红棕色

细胞，则判别为阳性<表明此样品为蓝舌病病毒)，否则，判为阴性

GB/'r186362002

5抗原捕获酶联免疫吸附试验(ntigencaptureEI,1SA)

5.1器械和设备

5.1.19(t孔高吸附性酶标实验板单道加样器(0.5[l,--10pL,5Id,-401,1,,40Id,-200pL,

2001,1一100(卜I，及滴头八道加样器(50川,100刃,150川,200川)及滴头，稀释试剂用小瓶。

5.1.2普通杠;温箱(37C)，水浴箱(37C)，魂(、、一20冰箱，微量振荡器，混合仪，酶标洗板仪及酶标读

板仪

5.2试剂与材料

5.2.1捕捉杭体:牛抗蓝舌病病毒23(BTV-23)型抗体，一20(保存

5.2.2检测杭体:兔抗蓝禹病病毒20(BTV-20))t9核芯抗体，一20(保存

5.2.3结合物:抗兔Ig(;辣根过氧化物酶结合物，4(、保存。

5.2.4溶液配制:碳酸盐缓冲液(pH9.4).乙酸柠檬酸盐缓冲液((p}-16.0);磷酸盐缓冲液(pl17.4)

四甲荃联苯胺储存液(室温避光保存);

3)(%过氧化},,L(I1,());

含脱脂奶的PBST(PI3SI'-SM)

配制方法见附录B(标准的附录)

5.2.59一11日龄鸡胚。

5.3样品处理

5.3.1对细胞培养物样品不需特殊处理使用前用PEST对倍稀释。

5.3.2对临床样品的处理方法见3.3.10

5.4实验设计和样品编号

5.4门侮个样.昂2孔，同时设蓝舌病病毒-1(BTV-I),蓝舌病病毒23(BIV-23)阳性对照各2孔，阴性

对照2孔(对照已知蓝舌病阳性和阴性细胞培养物或鸡胚肝脏悬液)。

5.4.2包被:用碳酸盐缓冲液(见Bi)对捕捉抗体作1。。。倍稀释，加人酶标实验板50川/孔，置密闭

湿盒中，4(·过夜

5.4.3用PBST(见BT)洗涤5次并晾十。

5.4.4加待检样品:按实验设计铸孔加样50I,l后，室温静置60min，再在37C振荡30mm

5.4.5用PBST洗涤5次。

5.4-6加检测抗体用BPST-SM(见B2)对检测抗体作1:2000稀释，每孔50pl加人实验板，37(

振荡30min.

5.4.7用PBST洗涤5次

5.4.8加酶结合物:用BPST-SM对酶结合物作T:3000稀释，母孔50pL加人实验板，37C振荡

30mill,

5.4.9用PBST洗涤5次

5.4.10加底物:按以下比例对底物进行稀释,9.7nli