DB51/T 2404-2017 大熊猫种群遗传档案建立技术规程

ICS65.020.40

B61

DB51

四川省地方标准

DB51/T2404—2017

大熊猫种群遗传档案建立技术规程

2017-09-19发布2017-10-01实施

四川省质量技术监督局发布

DB51/T2404—2017

目次

前言...............................................................................II

1范围..............................................................................1

2规范性引用文件....................................................................1

3术语和定义........................................................................1

4遗传标记选用原则..................................................................1

5实验流程..........................................................................2

6线粒体标记PCR方法................................................................2

7大熊猫性别鉴定的方法..............................................................3

8微卫星标记使用方法................................................................4

9遗传档案数据的管理和使用..........................................................5

附录A（规范性附录）大熊猫微卫星标记编号、名称、来源及PCR扩增引物..................6

I

DB51/T2404—2017

前言

本标准根据:GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的规定编写。

本标准由四川省林业厅提出并归口。

本标准由四川省质量技术监督局批准。

本标准起草单位：四川省野生动植物资源保护管理站。

本标准主要起草人：岳碧松、魏辅文、张和民、沈富军、杨旭煜、古晓东。

II

DB51/T2404—2017

大熊猫种群遗传档案建立技术规程

1范围

本标准规定了建立圈养大熊猫和野生大熊猫遗传档案的技术规程。

本标准适用于四川省圈养大熊猫和野生大熊猫遗传档案建立。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

DB51/T2288-2016野生大熊猫种群动态监测技术规程

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1

微卫星序列microsatellitesequence

是指基因组中由1-6个核苷酸为基本重复单元组成的DNA串联重复序列，例如（AC）n、（ACG）n、

（ATTT）n等，也称为短串联重复序列（Shorttandemrepeats，STR）或简单重复序列（Simplesequences

repeats，SSR）。在个体间重复次数发生变化的多态性微卫星位点，可以作为微卫星标记使用。

3.2

DNA样品DNAsamples

是指利用大熊猫组织（如毛发、血液、精液、肌肉组织等）或新鲜粪便提取的大熊猫基因组DNA。

4遗传标记选用原则

4.1线粒体标记

大熊猫线粒体控制区PCR扩增引物(Zhangetal.2007):

P-tp(5’-CTCCCTAAGACTCAAGGAAG-3’)

BEDH(5’-GGGTGATCTATAGTGTTATGTCC-3’)

PCR扩增产物长度为750bp左右。

4.2性别鉴定分子标记

优先使用大熊猫锌指蛋白基因（ZF）PCR扩增引物（Xuetal.,2009）：

GTf,5’-CAAGGATTTCCATGTAGCAGT-3’；

GTr,5’-ACTCTCCACAATGTCTACGGT-3’

1

DB51/T2404—2017

如果用上述引物对某些样品扩增困难，可采用以下2对引物进行组合扩增（Zhanetal.,2006;詹

祥江,2006）:

扩增Y染色体SRY基因的ZX1引物，产物片段大小210bp：

ZX1-F：5’-CTACATAGCCCCAACCCCTTTTC-3’

ZX1-R：5’-GGTTCTGGCCGCTGTCTCTACTAT-3’

扩增X染色体ZFX基因的引物，产物片段大小130bp，用于区分扩增失败与鉴定为雌性的情况：

ZFX-F：5’-ATAATCACATGGAGAGCCACAAGCT-3’

ZFX-R：5’-CTCCTTTTTCCTTATGCACC-3’

4.3微卫星标记

在进行圈养大熊猫和野生大熊猫微卫星相关工作时（包括个体识别、亲子鉴定、种群遗传管理、种

群监测、种群遗传多样性评估、种群遗传档案等），统一推荐使用30个微卫星标记（附录A），其中1-15

号为基本标记，16-30号为备选标记，可根据工作目标选用合适数量的微卫星标记。只有当基本标记不

够用时，才使用备选标记。

5实验流程

5.1线粒体标记扩增

使用4.1规定的线粒体标记引物对每个DNA样品进行PCR扩增，各取PCR产物2-5μL，用浓度为1.5%

的琼脂糖凝胶电泳来检测是否扩增成功，只有当PCR扩增成功的样品才进入后续分析。若两次提取、两

次扩增均不能成功，说明DNA质量不符合要求，应该放弃该样品的后续分析。

5.2微卫星分型

只对线粒体标记PCR扩增成功的样品进行微卫星标记分型检测；

从1-15号微卫星标记中选用6-8个标记对样品进行个体识别；

在个体识别基础上，根据研究目标从基本标记中选用更多标记对不同个体的DNA样品进行PCR扩增和

扫描分型；

如有多份DNA样品来自同一个体，选一份或多份参加后续分析，但必须注明样品编号，不要混合使

用；

5.3性别鉴定

使用4.2规定的性别鉴定分子标记引物对不同个体的DNA样品进行PCR性别鉴定。

6线粒体标记PCR方法

6.1引物合成

将4.1规定的大熊猫线粒体控制区PCR扩增引物序列送有关公司合成。

6.2PCR扩增体系及程序

2

DB51/T2404—2017

10×PCRbuffer2.0μL

MgCl2(25mmol/L)20μL

dNTP(2.5mM)1.0μL

Taqpolymerase(2.5U/μL)0.2μL

引物-F（15pmol/μL）1.0μL

引物-R（15pmol/μL）1.0μL

模板DNA2.0μL

ddH2O10.3μL

BSA(1mg/mL)0.5μL

合计20μL

PCR扩增程序：94℃预变性5分钟；然后在PCR扩增仪上进行40个循环。每个循环为94℃变性50s,55

℃退火45s,72℃延伸50s；最后在72℃延伸10分钟。PCR产物在4℃中保存。PCR产物经1.2%琼脂糖凝

胶电泳检测合格后送公司测序。

7大熊猫性别鉴定的方法

7.1PCR扩增引物的合成

将4.2规定的大熊猫性别鉴定PCR扩增引物序列送有关公司合成。

7.2PCR扩增体系及程序

10×PCRbuffer2.0μL