DB35/T 897-2009 食品中碱性橙、碱性嫩黄O和碱性桃红T含量的测定

DB35

福建省地方标准

DB35/T897—2009

食品中碱性橙、碱性嫩黄O

和碱性桃红T含量的测定

2009-03-11发布2009-04-01实施

福建省质量技术监督局发布

DB35/T897—2009

前言

本标准的附录A、B为资料性附录。

本标准由福建省质量技术监督局提出并归口。

本标准由福建省质量技术监督局批准。

本标准起草单位：福建省中心检验所。

本标准主要起草人：郑小严、黄红霞、林钦、戴明、黄永辉、梁敏、王征。

本标准系首次发布。

I

DB35/T897—2009

食品中碱性橙、碱性嫩黄O和碱性桃红T含量的测定

1范围

本标准规定了高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法测定食品中碱性橙、碱性嫩黄O和碱性桃红

T含量的方法。

本标准适用于蜜饯、水产品、豆制品、食用菌、炒货、坚果和固体调味品中碱性橙、碱性嫩黄O

和碱性桃红T含量的测定。

本标准高效液相色谱法检出限为：碱性橙0.02mg/kg；碱性嫩黄O0.03mg/kg；碱性桃红T

0.004mg/kg；定量限为：碱性橙0.06mg/kg；碱性嫩黄O0.1mg/kg；碱性桃红T0.02mg/kg。

本标准液相色谱-串联质谱法检出限为：碱性橙0.6µg/kg；碱性嫩黄O0.3µg/kg；碱性桃红T0.7µg/kg；

定量限为：碱性橙2µg/kg；碱性嫩黄O1µg/kg；碱性桃红T2µg/kg。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的

修改单（不包括勘误的内容）或修改版均不适用于本标准；然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究

是否使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3第一法高效液相色谱法

3.1原理

试样通过碱化甲醇提取，二氯甲烷萃取，正己烷净化，高效液相色谱紫外检测器串联荧光检测器同

时检测食品中碱性橙、碱性嫩黄O和碱性桃红T含量，外标法定量。

3.2试剂和材料

3.2.1除另有说明外，所用试剂均为分析纯，试验用水为符合GB/T6682规定的一级水。

3.2.2甲醇：色谱纯。

3.2.3甲酸：优级纯。

3.2.4氨水：优级纯，含量为25%。

3.2.5磷酸：优级纯。

3.2.6氯化钠。

3.2.7二氯甲烷。

3.2.8无水硫酸钠：650℃灼烧4h，在干燥器内冷却到室温，贮于密封瓶中备用。

3.2.9碱化甲醇：500mL甲醇（3.2.2）+10mL氨水（3.2.4）。

3.2.10酸化甲醇：500mL甲醇（3.2.2）+10mL甲酸（3.2.3）。

3.2.11甲醇饱和正己烷：正己烷加入少量甲醇，直至分层出现。

3.2.122%氨水（体积百分比）：取2mL氨水（3.2.4）用纯水稀释到100mL。

3.2.130.05%磷酸（体积百分比）：取0.5mL磷酸（3.2.5）用纯水稀释到1000mL。

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3.2.14碱性橙标准品（Chrysoidine，Cas532-82-1，C12H12N4·HCl，分子量248.71，纯度≥99%）。

3.2.15碱性嫩黄O标准品（AuramineO，Cas2465-27-2，C17H21N3·HCl，分子量303.83，纯度≥98%）。

3.2.16碱性桃红T标准品（SafranineT，Cas477-73-6，C20H19N4Cl，分子量350.84，纯度≥99%）。

3.2.17碱性橙、碱性嫩黄O、碱性桃红T混合标准储备溶液：准确称取20.0mg碱性橙、碱性嫩黄O

和碱性桃红T标准品，用甲醇（3.2.2）溶解定容到100mL,配制成200µg/mL的标准储备液。4℃冰箱放

置，3个月内使用。

3.2.18碱性橙、碱性嫩黄O、碱性桃红T混合标准溶液：准确移取适量混合标准储备液（3.2.17），用

酸化甲醇（3.2.10）稀释成0.05µg/mL～1µg/mL的标准系列。4℃冰箱放置，一周内使用。

3.3仪器与设备

3.3.1高效液相色谱仪：配紫外和荧光检测器。

3.3.2高速万能粉碎机。

3.3.3涡旋混合器。

3.3.4氮气吹干仪。

3.3.5水循环真空泵。

3.3.6旋转蒸发仪。

3.3.7超声波发生器（40KHz/600W）。

3.3.8冷冻高速离心机：15000r/min。

3.3.9分析天平（感量0.0001g和0.1g）。

3.3.10高速匀浆机。

3.4试样制备和保存

取有代表性样品500g，用粉碎机或匀浆机粉碎，混匀，分成2份，装入洁净容器内，密封并标识。

3.5分析步骤

3.5.1试样的提取净化

称取5g（精确到1mg）试样，置于50mL离心管中，准确加入20.0mL碱化甲醇（3.2.9），超声提

取30min；于4℃，15000r/min离心5分钟，移取5.0mL上清液于50mL离心管中，再加入10mL2%氨

水（3.2.12）和2g氯化钠（3.2.6）混匀，加入二氯甲烷（3.2.7）涡旋萃取3次，每次10mL；于4℃，

15000r/min离心5分钟，吸出下层萃取液合并，过无水硫酸钠（3.2.8）滤入250mL浓缩瓶中，40℃，

真空旋转蒸发至约剩1mL，用二氯甲烷转入10mL刻度试管中，40℃氮气吹近干，加入3mL酸化甲

醇（3.2.10）溶解残渣，用甲醇饱和正己烷（3.2.11）萃取净化3次，每次2mL，吸出正己烷层弃去，

40℃氮气吹至2mL以下，用酸化甲醇（3.2.10）定容到2.0mL，混匀，用0.2μm滤膜过滤后检测。

3.5.2高效液相色谱条件

a）色谱柱：C18，5μm，150×4.6mm（内径）或相当者；

b）柱温：30℃；

c）紫外检测波长：436nm（检测碱性橙和碱性嫩黄O）；

d）荧光检测波长：激发波长为271nm，发射波长为572nm（检测碱性桃红T）；

e）进样量：20μL；

f）流动相0.05%磷酸（3.2.13）与甲醇（3.2.2）梯度见表1。

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表1流动相及梯度表

时间流速0.05%磷酸甲醇曲线

（min）（mL/min）（%）（%）

017525/

8150506

151752511

201752511

（本方法条件为参考条件，可根据不同仪器、色谱柱进行调整。）

3.5.3定量测定

外标法定量：以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标

准工作曲线对试样进行定量，标准工作溶液和试样溶液的响应值均应在仪器检测线性范围内。在上述色

谱条件下，标准品色谱图见附录A中图A.。

3.6结果

3.6.1计算

试样中碱性橙、碱性嫩黄O、碱性桃红T的含量按式（1）计算：

×Vc

X=×k…………（1）

m

式中：

X——试样中碱性橙、碱性嫩黄O、碱性桃红T的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；

c——试样溶液中碱性橙、碱性嫩黄O、碱性桃红T的浓度，单位为微克每毫升（µg/mL）；

V——试样提取液体积，单位为毫升（mL）；

m——试样的质量，单位为克（g）；

k——稀释因子。

结果保留2位有效数值。

3.6.2重复性

在重复性条件下，获得的碱性橙、碱性嫩黄O、碱性桃红T的两次独立测试结果的绝对差值不大于

其算术平均值的15%。

4第二法液相色谱-串联质谱法

4.1原理

试样通过碱化甲醇提取，二氯甲烷萃取，正己烷净化，液相色谱-串联质谱联用法同时检测食品中

碱性橙、碱性嫩黄O和碱性桃红T含量，外标法定量。

4.2试剂和材料

4.2.10.4%甲酸（体积百分比）：取4.0mL甲酸（3.2.3）用纯水稀释到1000mL。

4.2.2其它同3.2。

4.3仪器与设备

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4.3.1高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪：配有电喷雾（ESI）离子源。

4.3.2其它同3.3.2～3.3.10。

4.4试样制备和保存

（同3.4）

4.5分析步骤

4.5.1试样的提取净化

（同3.5.1）

4.5.2高效液相色谱条件

a）色谱柱:C18，1.7μm，100¯2.1mm（内径）或相当者；

b）柱温：40℃；

c）进样量：3μL；

d）流动相0.4%甲酸（4.2.1）与甲醇（3.2.2）梯度见表2：

表2流动相及梯度

时间流速0.4%甲酸甲醇

曲线

（min）（mL/min）（%）（%）

00.37525/