DB15/T 1900-2020 过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型构建技术规程

ICS65.020.30

B44

DB15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T1900—2020

过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤

模型构建技术规程

Technicalregulationsforestablishmentofhydrogenperoxide-inducedoxidative

damagemodelofbovinemammaryepithelialcells

2020-06-10发布2020-07-10实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T1900—2020

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由内蒙古自治区农牧业科学院提出。

本标准由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。

本标准起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。

本标准主要起草人员：马燕芬、赵磊、吴志红、宋利文、凤英、张春华、乃门塔娜、羿静、宝华、

杜瑞平、高民、米丽。

I

DB15/T1900—2020

过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型构建技术规程

1范围

本标准规定了过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型的构建方法。

本标准适用于采用过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞产生氧化损伤模型的构建。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

2.1

原代细胞培养primarycellculture

将乳腺上皮细胞在模拟体内生存环境中进行培养，使细胞生长增殖达到可传代状态的培养方法。

3工作区条件

工作区由准备室、缓冲间、无菌室、细胞保存室组成。

4主要仪器、设备及耗材

4.1主要仪器、设备

超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、4℃离心机、4℃冰箱、-20℃冰箱、0.22μm过滤器、

80目滤网。

4.2主要耗材

25cm2细胞培养瓶、90mm细胞培养皿、15mL离心管、300mL烧杯、250mL蓝口瓶、1.5mLEppendof

管、2mL冻存管、6孔板、24孔板、96孔板、10μL-5mL移液枪及枪头、瓷盘、镊子、剪刀、贮液瓶。

5主要试剂及配制

5.1主要试剂

DMEM/F12培养基、10%胎牛血清、双抗、5%胰岛素转铁蛋白硒钠、氢化可的松、两性霉素B、表皮

生长因子、催乳素、L-谷氨酰胺、PBS缓冲液（pH7.4）、0.5%Ⅱ型胶原酶、10%二甲基亚砜（DMSO）、

30%过氧化氢、甲醇、高压灭菌超纯水、0.4%台盼蓝、75%酒精、新洁尔灭、0.25%胰酶、丙酮、10%

山羊血清、兔抗细胞角蛋白（cytokeratin）18单克隆抗体、山羊抗兔免疫球蛋白G、AlexaFluor488、

DAPI染液、四氮唑蓝盐化合物（MTS）、细胞裂解液、活性氧（ROS）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、

1

DB15/T1900—2020

超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒、过氧化氢酶（CAT）试剂盒、

谷胱甘肽巯基转移酶（GST）试剂盒、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒。

5.2培养基配制

5.2.1完全培养基（生长培养基，按配100mL计算）

将10%胎牛血清10mL、双抗1mL、5%胰岛素转铁蛋白硒钠0.5mL、100μg/mL氢化可的松100µL、

100μg/mL两性霉素B100µL、10ng/mL表皮生长因子10µL、50μg/mL催乳素50µL、200mmol/LL-

谷氨酰胺1.5mL加入86.74mL的DMEM/F12培养基中，0.22μm滤器过滤，密封分装，4℃保存。

5.2.2无血清培养基（饥饿培养基，按配100mL计算）

将双抗1mL、5%胰岛素转铁蛋白硒钠0.5mL、100μg/mL氢化可的松100µL、100μg/mL两性霉

素B100µL、10ng/mL表皮生长因子10µL、50μg/mL催乳素50µL、200mmol/LL-谷氨酰胺1.5mL

加入96.74mL的DMEM/F12培养基中，0.22μm滤器过滤，密封分装，4℃保存。

5.2.3终止培养基（按配100mL计算）

将10%胎牛血清10mL加入90mLDMEM/F12培养基中，0.22μm滤器过滤，密封分装，4℃保存。

5.3试剂配制

5.3.1氢化可的松（100μg/mL）

将100μg氢化可的松溶于1mL无水乙醇中，0.22μm滤器过滤，密封分装，-20℃保存。

5.3.2两性霉素B（100μg/mL）

将1mg两性霉素溶于10mL无菌超纯水中，0.22μm滤器过滤，密封分装，-20℃保存。

5.3.3表皮生长因子（10ng/mL）

将0.2mg表皮生长因子溶于20mLDMEM/F12培养基中，充分混匀，配制成10μg/mL的表皮生长因

子浓贮，取100μL10μg/mL浓贮溶于100mLDMEM/F12培养基中，即为10ng/mL表皮生长因子工作液，

0.22μm滤器过滤，密封分装，-20℃保存。

5.3.4催乳素（50μg/mL）

将250IU的催乳素