GB/T 16631-1996 柱液相色谱分析法通则

ICS71.040.40

c04

E

中华人民共和国国家标准

GB/T16631一1996

柱液相色谱分析法通则

Generalrulesforanalyticalmethods

ofliquidcolumnchromatography

1996一12一02发布1997一05一01实施

国家技术监督局发布

GB/T16631一1996

目次

一

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2月试验前的准备工作.·一·，····……，··········.··..·...·..·……9

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10色谱图的整理··················································“······················“···············……11

11定性分析················”···············，··········，···········”·················，，·”·················……n

12定量分析·一·11

13分子量的测定··············，····“·································.·，····································“……11

附录A(提示的附录)用于液相色谱法中溶剂的性质······，·····，，，····‘···，，············”·······，·…13

附录B(提示的附录)二元溶剂体系的组成与其强度的关系·······”·······················”··”····一15

附录C(提示的附录)溶剂的选择性三角坐标························································…·…16

附录D<提示的附录)离子交换色谱法中常用的缓冲剂.·17

附录E(提示的附录)柱填充剂·································”·.，，··，···················.··..·...·..·.·.……18

附录F(提示的附录)化学键合相柱填充剂······，·····“············.，·”·········，····”··············……19

附录G(提示的附录)环境要求.·21

附录H(提示的附录)安全要求·············。”················”·············”·······”··········“······…·…21

附录J(提示的附录)典型标准色谱图的操作参数······，··”·“·······““·一·21

附录K(提示的附录)鉴定分离组分的仪器和化学方法···········，········”······················……22

附录L(提示的附录)定量分析方法的计算公式.·一·22

附录M(提示的附录)使用普适校准进行分子量测定的M-H常数·····························……23

附录N(提示的附录)典型的体积排除色谱法色谱图··········································…·…24

附录P(提示的附录)平均分子量的计算示例·········“·“·······。·，·。，，·············”·.，··········…·…25

GB/T16631一1996

前言

本标准是参考日本JISK0124-1983K高效液相色谱分析通则》以及有关国内、国外资料按GB/T

1.1-1993《标准化工作导则第I单元:标准的起草与表述规则第I部分:标准编写的基本规定》制

定的。

日本JISK0124-1983仅仅适用于高效液相色谱法，内容简单。本标准适用于柱液相色谱法(包括

高效柱液相色谱法)，并且增加了章、条及其相关的内容。

本标准的附录A、附录B,附录C、附录D、附录E、附录F,附录G,附录H、附录J、附录K,附录L、附

录M、附录N,附录P都是提示的附录，

本标准由中华人民共和国化学工业部提出。

本标准由化学工业部标准化研究所归口。

本标准起草单位:化学工业部标准化研究所、天津大学。

本标准主要起草人:蔡建安、赵秋雯。

中华人民共和国国家标准

柱液相色谱分析法通则GB/T16631一1996

Generalrulesforanalyticalmethods

ofliquidcolumnchromatography

1范围

本标准规定了柱液相色谱(简称液相色谱，下同)分析法通则，适用于采用液相色谱分析法对无机、

有机化合物的定性、定量分析，以及对高分子化合物的分子量的测定的一般要求。

2引用标准

下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均

为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方面应探讨使用下列标准最新版本的可能性。

GB/T9008-88液相色谱法术语柱液相色谱法和平面色谱法

3方法概要

液相色谱分析法是在柱管内进行组分分离的液相色谱法。液体或固体试样用液态流体(溶剂或溶

液)作为流动相使其通过色谱柱，由于试样在固定相和流动相中分配系数和其他作用力的差异、或流体

力学体积的不同而被分离成各个组分，流动相中的各个组分通过特性检测器测量以及信号的记录，根据

各组分的保留值、峰高、峰面积等进行定性、定量分析和分子量的测定。

4仪器

液相色谱仪一般由分离、检测、记录等部件组成。如图1中所示。

图1液相色谱仪示意图

4.1分离部分

4.1.1储液器

存储流动相的容器，有的包括加热器、搅拌器、真空口和通惰性气体的人口。容器中已经纯化的流

动相，经烧结过滤头(5JAM)，由泵输送到色谱柱。储流器的材质不应该被流动相侵蚀和污染。一般应该

用玻璃，不锈钢或氟塑料等材质组成。

4.1.2泵

输送流动相的部件。可以得到所需的压力并能调节及提供稳定的、精确的流量(一般是0.1-9.9

国家技术监呀局1995一12一42批准1997一05-01实施

Gs/T16631一1996

mL/min)。使用于高效液相色谱的泵，可提供。一35MPa的压力。泵有往复泵、注射泵、气动泵、蠕动泵

等。泵体接触流动相的部分不应该被侵蚀和污染以及容易进行流动相的更换。

4.1.3梯度洗脱装置

供给二元或多元混合溶剂可按需要并连续改变组分配比的部件。梯度洗脱装置有两类。

4.1.31低压系统

流动相在常压下混合或流动相经电磁阀按比例进入泵，然后将其输入色谱柱系统。该装置所用的泵

应该是内体积小，使流动相在泵内的混合影响减至最小。如往复泵。

4.1.32高压系统

一般将两种流动相分别用泵增压，然后注入混合器中，再输入色谱柱系统。该装置所用的混合器的

体积要尽量小，使在开始进行混合和在柱的入口处出现梯度之间只需要很短的时间。混合器应该易于清

洗。

4.1.4进样装置

能将试样注人色谱柱的部件。目前使用的有三种方法。

4.1.4-1注射器

该法利用微量注射器(或一般注射器)将其针头穿过注射口处的隔膜直接把试样注入色谱柱。隔膜

材料不仅能经受高压，还应对溶剂有良好的稳定性，一般应该使用氟橡胶垫片。当压力大于10MPa时，

应使用停流进样技术。

4.1.4.2进样阀

该法利用六通阀和试样环管与色谱系统相连接，用微量注射器将试样注入并部分或完全充满环管，

通过阀切换使流动相把环管中的试样携带入色谱柱。六通阀必须能耐高压。环管一般用不锈钢制成，其

体积可从几个微升到几个毫升。对于使用小体积环管时，在阀的出口和色谱柱之间不能有明显的死体

积。

当更换试样时，应该清洗六通阀，以免前后不同试样的干扰。

4.1.4.3自动进样器

利用机械臂由微处理机控制，能将多个试样准确地、重现性地自动注入色谱系统，可以改变试样的

处理、进样、分析等条件，进行连续自动分析，也能紧急插入分析。

4.1.5柱箱

由加热、温度控制及测温元件等组成的容器。能够保持试验时所需要的温度和容纳试验所需用的色

谱柱。

一般柱箱温度的控制精度应在1%之内。在用于体积排除色谱法测定高分子化合物时，有时需要在

较高的温度下操作，以增加试样在流动相中的溶解度及降低流动相的粘度。

4.1.6柱管

一般用不锈钢、玻璃或其他合成材料等材质制成。必须能承受试验时的操作压力，不与流动相起化

学作用.柱管洁净，内壁光滑，耐腐蚀。

玻璃材质制成的柱管通常不能在高于1MPa时使用。

目前一般用内径4-8mm、长5^-30cm或内径1^-2mm、长10^.25cm的柱管。柱管的尺寸应与

柱填充剂的颗粒度相匹配.

4.2检测部分

4.2门检测器

检测器有时放置在能保持温度或高于柱箱温度的容器中。

目前使用的液相色谱检测器有两类。

总体性能检测器。如示差折光率检测器、(激光)光散射检测器、电导率检测器等。

溶质性能检测器。如紫外一可见光检测器、荧光检测器、红外光度计检测器等。

G6/T16631一1996

紫外一可见光检测器和示差折光率检测器是在液相色谱法中常用的二种检测器。

4.2.1.1紫外一可见光检测器对温度和流速的变化相对地不敏感，对紫外一可见光有吸收的试样都能

检测，其检测灵敏度由试样在该检测波长下的吸收系数决定，但在检测器波长范围内无吸收的试样则不

能检测。

选用的流动相必须在检测器所用的波长处无吸收或低吸收，梯度洗脱时，若有微小的吸收，则必须

进行背景扣除。用作流动相的溶剂，注意其紫外截止波长。

4.2.1.2示差折光率检测器对任何组分的折光率和流动相的折光率有差别时都可以使用。检测器对温

度的变化和流量的波动较敏感。

流动相组成的改变其折光率亦随之发生变化，因此，示差折光率检测器不能用于梯度洗脱。

4.2.1.3二极管阵列检测器。这是采用光电二极管阵列作为检测元件的紫外一可见光检测器，可以多

通道并列检测，或全光谱检测。

这种检测器主要特点:

—扫描速度快。可以在不停流的条件下获得洗脱组分的全光谱图，提供光谱资料;

—利用比较光谱法，判别色谱峰的纯度及分离状况。在色谱峰的前、后沿和峰高处各取一点，比较

这三个位置的光谱图，若三个光谱图完全相互匹配时，说明是纯峰，若不完全匹配，说明峰中有杂质;

—能绘制三维色谱图。由于扫描速度快，约10ms可以将190^-600nm整个光谱范围扫完，通过

三维色谱图能观察到试样中所有组分对波长的响应值，又由于每个组分都有全波段的光谱吸收图，因

此，可利用色谱保留值规律及光谱特征吸收曲线提高判别洗脱组分的性质的能力。

4.2.1.4(激光)光散射检测器是测量分子溶液的散射光强度，一般测定高分子物质的分子量。

42.1.5荧光检测器能测量某些组分在紫外光激发下所发射出的荧光，是一种很灵敏和选择性好的检

测器。

4.2.1电化学检测器可以在柱流出液中测量许多浓度很低的具有氧化或还原性、电导性以及一些离

子型的组分，是一种有选择性和灵敏性的检测器。

4.2.2流分收集器

用于收集流出液的装置。有手控和自动两种。

手控的流分收集器是根据需要分别收集保留值不同的组分于专用的管内。

自动的流分收集器是在确定收集保留值不同的组分，按照预定程序连续地打开或关闭相应的阀门，

使流出液自动流向固定的管内。

多次进样时，可以重复收集所需组分的流出液，达到制备纯化试样的目的。

收集流出液一般使用玻璃材质的容器.

4.3记录部分

4.3.1记录器

能够在条状图纸上用记录笔记录色谱图，显示各组分的色谱峰。

4.3.2数据处理装置

积分仪:按时间累积检测系统所产生的电信号，自动测定峰高及峰面积的数字积分器和打印机。

微处理机:通过微处理机与色谱仪的接口.将色谱信号及控制色谱仪各部分信号输送到微处理机.

微处理机可以按指令控制一台或多台色谱仪，并处理各种色谱信号，进行计算及控制外部事件。

5流动相

在液相色谱中由于流动相分子参与试样分子及固定相分子之间的作用，因此，在液相色谱法中流动

相的选择是重要的分离因素。

液相色谱法中使用的流动相一般应该满足下列要求:

—与试样、固定相不发生反应;

GB/T，6631一1996

—不使试样改变性质、而又能溶解试样;

—具有合适的溶剂强度;

—溶剂沸点应该高于分离温度20-50'C,粘度在分离温度下不超过。.5cP;

—必须与检测器匹配;

—用作流动相的溶剂(二种或二种以上)要互相溶解;

—安全，低毒。

5.1溶剂

在选择流动相时，必须考虑溶剂的各种性质。液相色谱法中用作流动相的溶剂的性质。见附录A(提

示的附录).

5.2分离度与k'值的关系

液相色谱法中相邻色谱峰的分离状况，可用分离度来表征。分离度可用公式(1)表示:

R一生石n二a1.:k'一，…….卜..……(:)

4.a1+澎

上式表明分离度受n(理论板数),a(分离因子)及k'(容量因子)三个独立的因素的影响(对分析一

般希望R=1.R=1，两色谱峰之间有2%的重叠,R=1.5，两色谱峰达到基线分离)。

柱效率愈高，分离愈好，因此，高效填充剂及有效的柱填充方法是取得高效色谱柱的关键。

从上面等式中，在。与。相同的条件下，Roc羔,k'在1-:之间对R值影响最大，一般在液相色

、一一行、”‘r动一，“’J“Jn””一“I+k'’一~-一~’一，，一吟~”「~2、’了扒一’、‘曰‘~

谱中控制在1^-10之间(对分离及分析时间都比较合适)，通过调节溶剂的配比，即调节溶剂强度，使组

分在此范围内进行洗脱。若在此范围内仍有某些组分不能分离，可以保持此合适溶剂强度的情况下，改

变流动相性质，达到改变a的目的((a与试样分子、流动相分子之间相互作用力有关)。

5.3溶剂强度与极性的表示

5.3.1溶剂强度参数:“。用硅胶，氧化铝柱填充剂测得。溶剂极性用溶剂强度参数e表示，CU值的大小

表示该溶剂洗脱能力的大小，对于试样所有组分来说，增加:“值意味着溶剂强度的增加和k'值的减少。

在液固色谱法中，一般都采用二元溶剂混合物作为流动相，一个溶剂为惰性溶剂.另一个为极性稍

强的溶剂，但混合后溶剂强度不呈线性变化。

二元溶剂体系的组成与其强度的关系，见附录B(提示的附录)a

5.3.2溶解度参数s。由沸点计算得到。是溶剂极性较好的表示方法，溶剂相对极性的量度。非极性溶

剂的S值小，极性溶剂的S值大，溶剂的分子与试样分子之间有相互作用力，即色散作用力6,1,偶极作用

力S.，接受氢质子的能力8.1氢质子给于能力Sh，一般由8值来控制溶剂强度，当k'值调节到合适范围

(1-<k'簇10)之后，根据试样的性质，可以用选择s值相近，但8,,8o,8.,氏值不同的另一种溶剂来改变选

择性。

5.3.3溶剂极性参数P,。是在溶解度基础上提出的，因此，在液一液色谱法中P,值可以提供一个具有

一定精度的溶剂强度的量度。根据分子间的作用力用X,(质子给于体).X.(质子接受体)，X.(偶极矩)

来代表溶剂的不同的作用力，并且将常用的溶剂按照选择性分成八个组，见附录C(提示的附录图I),

同一组内的溶剂具有相似的选择性，这样，当需要改变选择性时，在同一组内只需选择具有代表性的溶

剂即可。正相和反相色谱法中，利用溶剂的选择性三角坐标，见附录C(提示的附录图2)，可以大大地简

化正相和反相色谱法中溶剂的选择。当他们仍不能满足选择性要求时，可以考虑使用其他组的溶剂，或

者更精细地调节选择性时，可以采用三元溶剂体系，一般可以用基础溶剂浓度调节溶剂强度用另外二

种溶剂浓度比来调节选择性。

5.4正相和反相色谱法中用流动相

正相色谱法中，柱填充剂一般都具有极性(如硅胶、睛基、二醇基等化学键合相)。通常应采用非极性

溶剂、烃类溶剂(如正己烷、正庚烷、异辛烷等)作为基础溶剂，加入适当比例极性较强的溶剂组成混合溶

剂作为流动相。

Gs/T16631一1996

溶剂强度可以通过改变混合溶剂中极性溶剂的比例来调整。当增大溶剂P'值时，溶剂强度增加，试

样的k'值减少。如k'值超过10以后，组分仍达不到所需的分离度时，可以保持溶剂强度，用选择性三角

坐标中提供的不同性质的溶剂来改善色谱峰重叠组分的分离度。

反相色谱法中，柱填充剂一般都是非极性的(如键合辛基、十八烷基化学键合相)。通常应采用极性

较强的水作为基础溶剂，加入适当比例与之混合的极性较弱的溶剂(如甲醇)组成混合溶剂作为流动相。

溶剂强度一般通过改变加入水中溶剂的比例来调整，以达到组分的分离。当溶剂尸值‘增加时，溶剂

强度会降低，试样的k'值增大。若个别组分达不到所需的分离度时，则可以根据分子间不同作用力性质

的溶剂来改善，如用乙睛或四氢吠喃取代甲醇或加入到原来甲醇/水的溶剂体系中以改善分离。三元的

水溶性流动相能对某些分离提供极好的选择性。

5.5离子交换色谱法中用流动相

在离子交换色谱法中，流动相常用含盐的水溶液加入适当的改性剂(如甲醇、乙月部，用缓冲溶液保

持所需要的pH值。

溶剂强度和选择性由以下几种变量决定:缓冲离子和盐的类型和浓度;与水互溶的有机溶剂的类型

和浓度;流动相的pH值。

流动相的离子强度影响组分的保留值，当离子强度增加，溶剂强度亦随之增加，因为流动相中离子

的增加导致流动相离子对试样离子在离子交换位的竞争交换作用增大，致使试样离子加速洗脱。同时，

流动相离子的类型对溶剂强度有关，在阴离子交换中，具有相同浓度而不同的流动相阴离子，流动相溶

剂强度一般按以下顺序改变:

柠檬酸根>硫酸根>草酸根>甲酸根>乙酸根

在阳离子交换中，流动相离子类型的变化也影响溶剂强度，但差别很小，主要是各种阳离子的大小

和电荷变化较小，但有时阳离子类型的变化，可能改变选择性。

在离子交换色谱法中，pH值的变化对试样离子的离子化及柱填充剂的离子化程度都有影响，因

此，控制pH值的变化能改变流动相的溶剂强度，也能改变选择性。

离子交换色谱法中常用的缓冲剂，见附录D(提示的附录)。

5.6离子对色谱法中用流动相

离子对色谱法中可用正相或反相离子对色谱分离系统，一般反相分离系统的使用更为广泛。

反相分离系统用辛基、十八烷基化学键合相时，可采用甲醇/水或乙睛/水的混合溶剂作为流动相，

在适当的缓冲溶液中加人与试样分子形成非离子型的离子对。

组分的分离随流动相的pH值、缓冲溶液的盐离子浓度、离子对试剂烷基链的长短、溶剂的种类以

及温度等因素的变化而改变。

当改变一给定二元组分混合溶剂的相对浓度时，选择性的改变通常是很小的，一般通过改变溶剂来

改变选择性，而改变流动相的pH值是改善分离选择性的一个很有效的方法。

正相分离系统中，丁醇或戊醇与二氯乙烷、三氯甲烷和(或)正己烷的混合溶剂是通常使用的流动

相。

一般通过改变流动相的组成来改变分离选择性。

磷酸四丁基氯化钱和磷酸四丁基滨化按(用于酸性化合物)以及戊烷磺酸和庚烷磺酸(用于碱性化

合物)是常用的离子对试剂。

5.7离子色谱法中用流动相

5.7.1抑制型

一般选择用作流动相的洗脱剂应该是离子型水溶液，能从色谱柱上置换阴、阳离子，并在抑制柱上

发生交换反应，使洗脱离子变成低电导率物质(如水、碳酸等)后再进入电导检测系统，从而解决了洗脱

剂本身具有很高检测信号，即背景电导的干涉。

阴离子分离时，常用碱性洗脱剂，如氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、四硼酸钠等。碳酸氢钠和碳酸钠的

GB/T16631一1996

二元混合缓冲溶液是最通用的洗脱剂。

其他洗脱剂还有3一对经基丙氨酸、甘氨酸、硅酸盐、对氰酚等。

阳离子分离时，最基本的是酸性洗脱剂，如盐酸、硝酸等以及盐酸和间苯二胺或硝酸和硝酸锌二元

混合溶液洗脱剂。

5.7.2非抑制型

一般选择用作流动相的洗脱剂除和柱填充剂有足够的亲和力、并能将试样的阴、阳离子一一洗脱

外，应该是本身背景电导率较低的物质。不用抑制柱，洗脱剂通过色谱柱后直接进入电导检测系统。

阴离子分离时，苯甲酸盐和邻苯二甲酸盐的缓冲溶液(pH=4-7)是最常用的洗脱剂。

柠檬酸盐是一种具较强洗脱能力的洗脱剂，阴离子的洗脱顺序和邻苯二甲酸盐相同。

氢氧化钾和酚盐的混合碱性洗脱剂对弱酸阴离子能够得到有效的分离。

对于多价阴离子，如磷酸等，可用葡萄糖酸盐加入四硼酸钠和H,BO。的较强缓冲能力的洗脱剂洗

脱。

阳离子分离时，一般采用硝酸、盐酸等洗脱剂以及乙二胺硝酸盐洗脱剂。

用具有选择性络合能力的洗脱液可以成功地分离很多阳离子，如乙二胺阳离子加酒石酸根或经

基异丁酸根组成的洗脱剂都具有很好的分离效能。

在离子色谱法中，常常是通过改变流动相来改变选择性，选择适当的洗脱剂是改善分离的有效方

法。其次，洗脱剂的离子强度和pH值也是选择性和分离的有效因素。

5.8体积排除色谱法中用流动相

体积排除色谱法与其他液相色谱法不同，不采用改变流动相的方法来改善分离度。流动相的选择主

要考虑其溶解试样的能力与柱填充剂的匹配以及在分离时的温度下是否具有低粘度，因为高粘度的流

动相将限制扩散作用，降低分离度。

流动相必须与检测器匹配外，也必须考虑流动相与柱填充剂的匹配，用强极性溶剂丙酮，乙醇，二甲

基亚矾和水作流动相时，通常不能用于聚苯乙烯柱填充剂。在使用软质凝胶时，必须在流动相中加入盐

类以保持离子强度，防止离子型试样通过色谱柱时导致凝胶收缩及色谱柱的渗透性降低。而使用硬质凝

胶(如硅胶)时，含水的流动相中的pH值必须保持在2-8.5之间，防止柱填充剂降解。

5.9梯度洗脱

在分离k'值范围较宽的复杂的混合组分采用梯度洗脱技术，对流动相的要求应该是溶剂强度随时

间而呈一定规律的变化，使得到的色谱图上的各个组分的谱带都有良好的分离。梯度洗脱可以改善分

离，缩短组分洗脱的时间以及提高低含量组分检测的灵敏度。

5-10溶剂的纯化

用作流动相的溶剂在使用之前，应该除去液体中的固体杂质，必要时，还应该纯化，纯化时通常使用

硅胶、氧化铝、有时亦使用蒸馏。最好使用专门用于高效液相色谱的纯溶剂。

一般采用加热回流、超声波振荡、通入氮或氦气或真空方法脱气，除去溶解在流动相中的空气、僻免

在分离过程中在泵、色谱柱、检测器里形成气泡，消除流动相中存在的痕量氧气对试样、流动相、柱填充

剂的氧化降解作用。

6柱填充剂

高效色谱柱是现代液相色谱系统的核心，他能提供分离的组分生最小的谱带加宽。因此，良好的柱

填充剂必须是能填充均匀，固定相传质阻力很小的物质。

一般使用的柱填充剂应该是:

—固定相与流动相必须是互不相溶的;

—具有高比表面积的粒状物质或一定孔径的多孔物质;

—具有良好的机械性能。

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6.1液一固色i法中柱填充剂

一般采用具有较大比表面积((50-100m'/g)的吸附剂，通常是硅胶、氧化铝等。有多孔型住填充剂

和薄壳型柱填充剂，前者有球形和无定型二种形状。

目前大多数液一固色谱法中使用的是5^10pm范围的多孔型球形硅胶柱填充剂。

对酸敏感或者能起催化反应的试样，可以考虑使用氧化铝。

吸附剂表面上吸附的水分子，在吸附分离性能中具有重要作用，而吸附剂水含量的控制通常是依靠

改变流动相中的水含量来实现，一般用等水溶剂作流动相。使用等水溶剂有以下益处:

一一每次分离时，组分的保留值变化不大;

—在某些情况下可获得较高的柱效率和减少谱带的拖尾;

一一部分补偿不同批号同类吸附剂之间的差别;

—在分离过程中，可减弱吸附剂对试样的不必要的催化反应。

其次，流动相中加入改性剂也能改善分离性能。

液一固色谱和液一液色谱法中用柱填充剂和载体，见附录E(提示的附录表El),

6.2液一液色谱法中柱填充剂

一般是在惰性载体上均匀地涂渍一层固定液或者是用在玻璃珠实心核的表面沉积一层多孔活性涂

层一〔般用硅胶，也可有氧化铝)，形成表面多孔层颗粒，(多孔层厚度一般为1^-3pm)在此表面多孔层

上再涂渍一层固定液的薄壳型柱填充剂，

由于机械涂渍的固定液容易流失.因此，目前在液一液色谱法中多数都使用化学键合相填充剂。

6.2.1化学键合相柱填充剂

化学键合相填充剂是为了克服机械涂渍固定液在液一液色谱法中的不足而发展起来的，由于固定液

是经化学键合到载体上的，在使用过程中不易洗脱或者流失，所以.色谱柱性能相当稳定。

化学键合相填充剂一般是在硅胶表面上的硅醇基团与各种有机化合物或有机硅化合物反应，键合

上各种特定的基团而成的。这些特定基团，除烷基外，还有芳香基、月青基、硝基、烷基胺、二醇基等，形成具

有不同极性的化学键合相填充剂。

化学键合相填充剂有三种形式:

Si-O-R硅酸醋)该填充剂容易水解，热稳定性差，目前已较少使用。若使用硅酸醋填充剂时，只能

用不含水和醉的流动相。

Si-C和Si-N该填充剂的水解和热稳定性比硅酸醋填充剂性能好。但是，在填充剂表面常会留下一

些无用的残基，彩响组分的保留特性或使色谱峰拖尾。当使用水溶液作流动相时，必须将pH值限制在

花_,8的范围之内。

Si-O-Si-R(硅氧烷)该填充剂是通过硅醇基与单、二或三抓硅烷、二甲基、氨基、硅氧基或烷氧基硅

烷反应而制得的单分子层的键合相填充剂。

这种填充剂在2-8.5的pH值范围内水解稳定性是很好的，热稳定性也好，是目前质量最好、应用

最广泛的化学键合相填充剂。

如果键合的基团部分(R)含有官能团，如辛基、十八烷基等，得到的就是非极性化学键合相。若含有

官能团.如磺酸基、氨基}}Y基等，得到的就是极性化学键合相。

化学键合相填充剂比机械涂渍固定液的固定相有很多优越之处:

一不需使用顶饱和柱;

--一由于固定液永久性地键合在载体上，所以，在洗脱过程中，固定液不易洗脱或流失，流出液不受

固定液污染，增加色谱柱的稳定性和寿命;

-一具有很高的住效率和在高压下有很好的机械性能;

—能够采用各种程序控制技术，包括梯度洗脱;

一一由于可以键合到载体上的官能团的种类很多，因而，正相和反相色谱的分离都可以用最简单的

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直接的方式完成。

液相色谱法中使用的化学键合相柱填充剂，见附录F(提示的附录)。

6.3离子交换色谱法中柱填充剂

离子交换色谱法中使用的柱填充剂应该是:

—离子交换物质应该是不溶解的;

—具有化学稳定性;

—有一定的离子交换容量;

—在一定压力下，离子交换填充剂结构应该是稳定的，理想的应该是均匀的球状颗粒。

一般使用的离子交换柱填充剂是用聚苯乙烯和二乙烯基苯共聚物基体，被离子型官能团所取代的

产物的聚合多孔型填充剂。

最常用的是具磺酸基(-SO,H)的阳离子的和具三烷基按(-NR,)`的阴离子的普通的树脂型离子交

换剂。

薄壳型填充剂用玻璃微球或表面多孔微粒(薄壳硅胶)作基体，再涂溃一层聚合的有机离子交换剂。

化学键合相柱填充剂是以硅胶为基体，然后在上面键合上一层聚合物，除聚苯乙烯外，还可用其他

聚合物(如硅酮、氟碳聚合物)，再可引入离子交换基团。

由于硅胶基体在pH值超过8.5时开始溶解，所以他们在强碱条件下不能应用。

其次，也可以在多孔型或薄壳型硅胶上涂渍液体离子交换剂。

离子交换剂中由于不同的官能团而表现出不同的特性。因而，在选择离子交换剂时，不同的聚合相

和不同的取代基的离子交换剂(强、弱离子交换剂)可以使组分的分离顺序或分离选择性产生差异。对于

两性化合物(如氨基酸、蛋白质等)，在一定的pH值下，可以用阳或阴离子交换剂分离。

离子交换剂中离子交换容量很重要，组分的相对保留值和试样的负载量随离子交换容量的增加而

增大。

离子交换色谱法中用柱填充剂，见附录E(提示的附录表E2),

6.4离子对色谱法中柱填充剂

离子对色谱法中大多采用微粒的((5^-10J}m)多孔型柱填充剂。

反相分离系统中，目前通常使用非极性化学键合相柱填充剂。

正相分离系统中，一般使用多孔型硅胶作载体，以机械吸收并加有反离子的缓冲水溶液作固定液。

但是必须防止反离子从固定相中流失以及水相必须有充分的缓冲作用。

6.5离子色谱法中柱填充剂

离子色谱法中，一般用多孔型和薄壳型柱填充剂。

抑制型。色谱柱常用离子交换容量低、而有很高分离效能的薄壳型离子交换剂。抑制柱填充离子交

换容量高的中、高交联度的强酸型阳离子或强碱型阴离子交换剂，但是，填充抑制柱在抑制柱容量耗一

半时，往往会产生基线变差的现象.因此，在使用一定次数后必须再生。纤维抑制柱是通过离子交换纤维

膜来进行抑制反应，但仍受洗脱剂强度和性质的限制，也不能用于梯度洗脱。新型的平板微膜抑制柱是

同时具有填充抑制柱的离子交换容量高和纤维抑制柱的能自动连续再生及保持动态平衡的优点.适用

于梯度洗脱。

非抑制型。色谱柱一般采用离子交换容量低的多孔型离子交换剂。

6.6体积排除色谱法中柱填充剂

体积排除色谱法中使用的柱填充剂按照化学类型分为三类:软质、半硬质和硬质凝胶。

软质凝胶。适合于用水溶液作为流动相，这种技术称凝胶过滤色谱法。由于色谱柱渗透性小，只能

在低流速下使用，其次承受压力也很小，因而也不能在高压下使用。一般分离水溶性的小分子量的物质。

半硬质凝胶。适合于用有机溶剂作为流动相，这种技术称凝胶渗透色谱法。由于色谱柱渗透性良好

并具有较好的强度，所以，可在较高的压力下提高流速时使用。一般孔径范围能适用于从小分子量到分

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子量超过10,的大分子的分离

硬质凝胶。可用水溶液或有机溶剂作为流动相。由于色谱柱渗透性很高，强度好，可以在较高压力

下的高流速时使用。一般孔径范围适用于分子量从10'^-10‘的大分子的分离。

在体积排除色谱法中，由于柱填充剂的孔径的大小决定了试样分子量分离的范围，因此，在选择柱

填充剂时，理想的柱填充剂在分子量对保留值的校准曲线图上，试祥分子大小的保留值应该是在排除极

限和渗透极限之间的线性渗透性范围之内。

体积排除色谱法中用柱填充剂，见附录E(提示的附录表3).

试验前的准备工作

7.1仪器

液相色谱仪安放的地点应该符合环境要求，见附录G(提示的附录)，与色谱柱及流路的连接应该严

密，在试验设定的压力(高压或低压)条件下，不能漏液，流速稳定。

仪器的灵敏度、基线漂移应该满足试验的要求。

7.2色谱柱的填充方法

填充色谱柱的最佳步骤主要取决于所用的柱填充剂的性质和颗粒大小(粒径)。填充良好的色谱柱

应该是没有消沟、裂痕和颗粒粒径分级的、均匀的填充床。

柱填充剂要尽可能的紧密，但不能使颗粒破裂。

7.2.1干法填充

干法填充的方法与气相色谱法填充色谱柱基本相同。适用于粒径>20}m的柱填充剂的填装。一般

将柱管的一端用金属网，多孔烧结片，多孔滤网堵住，在振动柱管或减压情况下装入柱填充剂，待填充均

匀、紧密以后，再将柱管的另一端堵住。

7.2.2匀浆填充

使用的柱填充剂会在溶剂中溶胀或颗粒直径小于20}Lm时，一般采用匀浆填充。

一般