DB37/T 4460-2021 规模化牛场气溶胶中口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量RT-PCR/PCR检测技术规程

ICS11.220

CCSB41

37

山东省地方标准

DB37/T4460—2021

规模化牛场气溶胶中口蹄疫病毒、牛病毒性

腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒实时荧

光定量RT-PCR/PCR检测技术规程

Real-timefluorescencequantitativeRT-PCR/PCRdetectiontechniquefor

foot-and-mouthdiseasevirus,bovineviraldiarrheavirusandinfectiousbovine

rhinotracheitisvirusinaerosoloflarge-scalecattlefarms

2021-12-27发布2022-01-27实施

山东省市场监督管理局发布

DB37/T4460—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起

草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。

本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。

I

DB37/T4460—2021

规模化牛场气溶胶中口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻

气管炎病毒实时荧光定量RT-PCR/PCR检测技术规程

1范围

本文件规定了规模化牛场气溶胶中口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒荧光定

量RT-PCR/PCR检测技术。

本文件适用于畜舍环境及疫区环境气溶胶中口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病

毒检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

FMD：口蹄疫

FMDV：口蹄疫病毒

BVDV：牛病毒性腹泻病毒

IBRV：牛传染性鼻气管炎病毒

PCR：聚合酶链式反应

RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应

DNA：脱氧核糖核酸

RNA：核糖核酸

cDNA：与信使RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA

AGI：全玻璃液体冲击式采样器

PBS：磷酸盐缓冲生理盐水

5试剂或材料

1

DB37/T4460—2021

5.1除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，水应符合GB/T6682要求。所用液体试剂均需

使用无DNA/RNAase的容器进行分装。

5.2体积比25:24的酚：氯仿溶液，应2℃～8℃保存见A.1。

5.3体积比24:1的氯仿：异戊醇溶液，应2℃～8℃保存见A.2。

5.40.1%DEPC水。

5.5无水乙醇，应-20℃预冷。

5.675%乙醇，配置见A.5，应-20℃预冷。

5.7TE缓冲液，配制见A.6。

5.82mol/LNaAc溶液，配制见A.7。

5.9阳性、阴性对照。

——阳性对照：分别为带有FMDV5′-UTR基因、BVDV5′-UTR基因和IBRVgD基因的质粒，制备见附

录B。

——阴性对照：分别为已知FMDV、BVDV阴性气溶胶样本的cDNA和IBRV阴性气溶胶样本DNA。

6仪器设备

6.1空气微生物采样箱。

6.2荧光PCR检测仪及配套反应管（板）。

6.3高速冷冻离心机，最高转速应不低于13000r/min。

6.4冰箱，2℃～8℃和-20℃两种。

6.5微量移液器及配套吸头，量程规格应包含5L、10L、100L和1000L。

6.61.5mL离心管，应无DNAase和RNAase。

6.7电热恒温水槽（室温至100℃）。

6.8涡旋振荡器。

6.9天平（精密度千分之一以上）。

6.10Ⅱ级生物安全柜A型。

7气溶胶样品

7.1气溶胶样品的采集、灭活处理

应用空气微生物采样箱，使用国际标准的AGI采集样本。样品采集后立即用1%甲醛溶液灭活处理。

采集方法与注意事项应按照附录C。

7.2样品贮运

样品采集后，放入密闭的自封袋内（一个采样点的样品，放一个自封袋），于保温箱中加冰、密封，

24h内送实验室。

7.3样品保存

样品在2℃～8℃条件下保存不应超过24h，若长期保存应置-70℃以下，应避免反复冻融（冻融不

超过三次）。

8实验步骤

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DB37/T4460—2021

8.1实验室规范

荧光RT-PCR检测方法的实验室规范应符合GB19489和GB/T27401要求，整个实验过程中均须使用无

DNAase/RNAase的一次性耗材，用到的玻璃器皿使用前须250℃干烤4h以上，以彻底去除DNAase/RNAase。

8.2样品病毒核酸RNA和DNA提取

所提取物为气溶胶采集液，可能含有病毒。操作者必须带口罩和一次性手套，RNA提取尽量在人少

时进行，防止空气中RNAase的污染。所用物品也应无RNAase。

8.2.1样品病毒核酸RNA提取

在1.5mL的离心管中加入样品上清液200μL，再加入TRIzol1mL，充分混匀，室温放置10

min。

加入200μL的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相

现象），室温放置10min。

4℃离心、13000r/min、15min，取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相）。

加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min。

离心4℃、13000r/min、15min，用枪小心吸去所有上清。

加1mL75%乙醇洗一遍，离心4℃、8000r/min、10min，用枪小心吸去所有上清，重复此

步骤，在超净台中干燥5min。

加入50μLTE缓冲液溶解RNA，-20℃保存备用。

可采用经验证的病毒RNA提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取RNA。

8.2.2样品病毒核酸DNA提取

在1.5mL的离心管中加入样品上清液200μL，加入450μL裂解缓冲液，再加入20μL蛋

白酶K，充分混匀，55℃15min。

加入700μL的酚：氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无

分相现象），室温放置10min。

13000r/min、15min，取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相）。

加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min。

13000r/min、15min，取上清液相移入另一管。

加入1/10体积2mol/LNaAc和等体积预冷的无水乙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室

温放置10min。

13000r/min、5min，用枪小心吸去上清，加1mL75%乙醇洗一遍，8000r/min、10min，

用枪小心吸去所有上清，重复此步骤，在超净台中干燥5min。

加入50μLTE缓冲液溶解DNA，-20℃保存备用。

可采用经验证的病毒核酸提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取DNA。