GB/T 31792-2015 向日葵茎溃疡病菌检疫鉴定方法

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中华人民共和国国彖标准

GB/T31792—2015

向日葵茎溃疡病菌检疫鉴定方法

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2015-07-03发布2015-11-27实施

GB/T31792—2015

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本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。

本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国合格评定国家认可中心、中华人民共和国新疆出

入境检验检疫局。

本标准主要起草人：吴品珊、杜洪忠、蔡露敏、张祥林、严进。

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GB/T31792—2015

向日葵茎溃疡病菌检疫鉴定方法

1范围

本标准规定了向日葵茎溃疡病菌的检疫鉴定方法。

本标准适用于向日葵植株和种子中向日葵茎溃疡病菌的检疫和鉴定。

2仪器和用具

2.1仪器

体视显微镜、生物显微镜、超净工作台、光照培养箱、电子天平(1/1000g)、高压灭菌锅、冰箱、PCR

扩增仪、荧光PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅。

2.2用具

烧杯、三角瓶、量筒、试管、培养皿、酒精灯、银子、剪刀、解剖刀、接种针、载玻片、盖玻片、塑料研杵、

移液器、移液器吸头、离心管、液氮罐、样品筛(10目，01.7mm)0

3试剂和培养基

3.1试剂

葡萄糖，链霉素，乳酸，琼脂,1.0%次氯酸钠(NaClO)液氮,Tris-HCl,MgCl2,HC1,EDTANaOH

NaOAcKC1TrisCTABTAE无水乙醇(Ethanol)三氯甲烷(Chloroform)异丙醇(Isopropanol)异

戊醇(Isoamylalcohol),SYBRGreenI核酸染料，蛋白酶K,TaqDNA聚合酶，dNTP通用引物TTS5

和ITS4实时荧光PCR特异性引物DH-F.DH-R及探针DH-Pr0

3.2培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)链霉素马铃薯葡萄糖琼脂培养基(SPDA)0具体配方参见附

录Ao

4检疫鉴定方法

4.1症状检查

采集田间疑似症状的茎杆、病叶或葵盘，剪取病健交界处的组织材料备用。病害典型的症状是茎杆

和叶柄处有淡褐色溃疡病斑，详见附录A病害症状描述。

在种子中挑选干瘪、变色、皱缩、残缺或霉变的种子，同时挑选其中夹带的向日葵残体，如叶柄、茎

杆、花盘碎片等。

4.2分离培养

将有疑似症状的叶片、叶柄、茎杆、花盘碎片等样品在病健交界处剪取5mm〜10mm的小块，用

1

GB/T31792—2015

1%次氯酸钠表面消毒5min~10min灭菌水冲洗3次，用灭菌滤纸将水吸干后，置于含链霉素的

SPDA培养基平皿中，25°C、8h光照/16h黑暗条件下培养，3d〜5d后开始观察。

将种子样品用1%次氯酸钠表面消毒5min〜10min灭菌水冲洗3次，保持无菌状态，在室温25°C

下放置24h再在一20°C下冷冻24h然后转至含链霉素的SPDA培养基平皿中，25°C、8h光照门6h

黑暗条件下培养，3d〜5d后开始观察。

有种衣剂的种子，先将种衣剂洗掉(参见附录A)再进行上述操作。

4.3生物学鉴定

如在SPDA培养基上观察到真菌菌落,转接到PDA培养基平皿上纯化培养，5d~7d后开始观察

记录病菌的培养性状，显微镜下观察记录分生抱子和分生抱子器的形态和大小。

4.4分子生物学检测

4.4.1DNA提取

收集分离到的真菌菌丝，采用CTAB方法提取DNA(参见附录B)。

4.4.2实时荧光PCR检测

实时荧光PCR引物序列为DH-F：5'-CGCTTATCTCTTACACCAAAACCCT-3'DH-R：

5'-GCAGCTATTGAAACAGCTCATCTG-3',TaqMan探针DH-Pr：5'-FAM-ATGCACCCACCGCA

CTCCTGC-BHQ-l-3\探针5’端标记的荧光报告基团为FAM3’端标记的荧光猝灭基团为BHQ-1。

反应体系(25“L)：样品DNA1mL,10XPCR缓冲液2.5”L,25mmol/LMgCl22ML,2.5mmol/L

dNTPs2yL,