GB/T 22916-2008 水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测方法

ICS11.220

B41

中华人民共和国国家标准

GB/T22916—2008

水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测方法

ProtocoloffluorogenicRT-PCRforvesicularstomatitisvirus

2008-12-31发布2009-05-01实施

发布

GB/T22916—2008

-1.Z-—1—

刖弓

本标准参考了世界动物卫生组织（（）IE）《陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、禽鸟与蜜蜂）》

（第5版）。

本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。

本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检

疫局c

本标准主要起草人：花群义、周晓黎、曾少灵、曹琛福、詹爱军、张彩虹、林庆燕、陈兵、杨云庆、孙洁。

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GB/T22916—2008

水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测方法

1范围

本标准规定了水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测的操作方法。

本标准适用于动物及其产品中水泡性口炎病毒的检测。

2缩略语

下列缩略语适用于本标准。

2.1荧光RT-PCR

荧光反转录-聚合酶链反应。

2.2Ct值

每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值吋所经历的循环数。

2.3RNA

核糖核酸。

2.4DEPC

焦碳酸磷酯。

2.5PBS

磷酸盐缓冲盐水（配方见附录A）o

2.6Taq酶

TagDNA聚合酶。

2.7VSV

水泡性口炎病毒。

3原理

水泡性口炎病毒属RNA病毒，根据水泡性口炎病毒两型共有基因特定的序列，合成一对特异性引

物和一条特异性的荧光双标记探针。通过严格设计和筛选的引物和探针，涵盖水泡性口炎病毒的两个

型和突变株，为水泡性口炎病毒的特异性通用引物和探针。探针的5’端标记FAM荧光素，它发出的荧

光能够被检测仪器接收,称为报告荧光基团；3'端标记TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收5’端报告

荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团。在扩增时,Taq酶发挥它的5'~3‘端外切核酸酶的功

能，将探针水解成单核昔酸，消除阻碍，标记在探针两端的报告荧光基团和淬灭荧光基团均游离于溶液

中，仪器检测到发出的荧光信号。

4材料与试剂

4.1仪器与器材

4.1.1荧光RT-PCR检测仪。

4.1.2高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/min以上）。

4.1.3台式离心机（离心速度3000r/min）0

4.1.4混匀器。

4.1.5冰箱（2°C〜8°C和一2（TC两种）。

4.1.6微量可调移液器（5mL,10mL,100mL,1000ML）及配套带滤芯吸头。

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GB/T22916—2008

4.1.7Eppendorf管（1.5mL）、透明薄壁PCR管（0.2mL）。

4.2试剂

4.2.1除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器（用DEPC

水处理后高压灭菌）分装。

4.2.2三氯甲烷。

4.2.3异丙醇：一20C预冷。

4.2.4PBS：配方见附录A。

4.2.575%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20C预冷。

4.2.6水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测试剂盒：组成、功能及使用注意事项参见附录B。

4.2.7引物：上游引物为5ATGGCTCCTACAGTTAAGAGAATCA-3'，下游引物为5'-TGAAG-

TAATCAGCCGGGTATTC-3'。

4.2.8荧光双标记探针（10fjtmol/L）:（FAM）5Z-CGAAATTACCGGCCAACGAGGATC-37（TAM­

AR）,扩增目标片段长度为97bp0

5抽样

5.1采样工具

5.1.1下列采样工具应经121°C±2°C,15min高压灭菌并烘干。

5.1.2棉拭子。

5.1.3剪刀、银子。

5.1.4注射器。

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