RB/T 033-2020 微生物检测方法确认与验证指南

ICS03.120.00

A00 RB

中华人民共和国认证认可行业标准

RB/T033-2020

微生物检测方法确认与验证指南

Guidanceonverificationandvalidationofmicrobiologicaltestingmethods

2020-8-26发布2020-12-01实施

国家认证认可监督管理委员会 发布

R

RB/T033-2020

目 次

前言……………………III

1范围…………………1

2规范性引用文件………………………1

3术语和定义……………1

4方法确认………………1

4.1总则……………3

4.2特性参数的选择………………4

4.3确认方式………………………4

4.4特性参数的确认………………5

5方法验证………………8

5.1总则……………8

5.2特性参数的选择………………9

5.3定性方法………………………9

5.4定量方法………………………9

附录A（资料性附录）定性方法确认中配对和不配对研究的可接受性限参数和限值…………11

附录B（资料性附录）根据每个污染水平的阳性结果数量估算LODso…………12

参考文献…………………13

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本标准起草单位t中国合格评定国家认可中心、青岛海关技术中心、大连海关技术中心、深圳华大基因科技有限公司、浙江天科高新技术发展有限公司、沈阳海关技术中心、辽宁省疾病预防控制中心。

本标准主要起草人：李宏、唐丹舟、陈延青、姜英辉、单耕、刘淑艳、张娜、李明哲、武维伟、候君钊、富宏坤、陈欢、付海滨、杨晓婷、孙晓辰、曲晓明、王彦斌。

RB/T033—2020

微生物检测方法确认与验证指南

1范围

本标准给出了实验室对微生物检测方法进行方法确认和方法验证的指南。

本标准适用于实验室对其制定的方法．超出其预定程围使用的标准方法、扩充和修改过的标准方法的方法确认，也适用于实验室对新引入标准方法正式使用前的方法验证。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件．其最新版本〈包括所有的修改单〉适用于本文件。

ISO16140-2食品链微生物学第2部分：用于参考方法的替代方法确认规范［Microbiologyofthefoodchain-methodvalidation-Part2:Protocolforthevalidationofalternative(proprietary)methodsagainstareferencemethod]

ISO/IEC17025:2017检测和校准实验室能力的通用要求［Generalrequirementsforthecompetenceoftestingandcalibrationlaboratories]

ISO/IEC指南99:2007国际计量学词汇基本和通用概念及相关术语［Internationalvocabularyofmetrology-Basicandgeneralconceptsandassociateterms(VIM)]

3术语和定义

ISO/IEC指南99:2007和ISO/IEC17025:2017界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

3.1

方法验证 methodverification

实验室通过核查或试验，提供客观证据证明满足检测方法规定的要求。即提供客观证据以证明实

验室能够正确运用该方法，确保实现所需的方法性能。

3.2

方法确认 methodvalidation

实验室通过试验，提供客观证据证明待定方法满足预期的用途。

洼1：方法确认宜识别影响方法做能的因索及影响程度，验证方法的性能特性，并确定方法所适用的基质及使用的限制条件．

注2：确认可包括对抽样、检测物品的处置和运输程序的确认。

3.3

参考方法referencemethod

国际、国家、行业或组织认可并被广泛接受的方法。

3.4

定性方法 qualitativemethod

用直接或间接的方法检测目标微生物是否存在的分析方法。

3.5

定量方法 qoantitath:emethod

对一定数量的样品进行直接（如：对一定质量或体积样品进行计数）或间接（如：吸光值、阻抗等）测量目标微生物数量的分析方法。

3.6

确证方法 confirmatorymethod

能够提供目标物全部或部分信息，依据这些信息可以明确定性，在必要时可在关注的浓度水平上进行定量的方法。

3.7

筛选方法screeningmethod

具有高效处理大量样品的能力，用于检测一种物质或一组物质在所关注的浓度水平上是否存在的方法。

注：这些方法用于筛选大量样品可能的阳性结果，并用来避免假阴性结果，此类方法所获得的检测结果通常为定性结果或半定量结果。

3.8

灵敏度sensitivity

参考方法或待确认方法检测分析物的能力。

3.9

相对正确度relativetrueness：RT

相同的样品用待确认方法和参考方法测试结果的一致程度。即待确认方法和参考方法均确证为阳性的数量与均确证为阴性的数量之和除以用于确认的样品数量。

3.10

检出水平levelofdetection；LODx

微生物定性检测方法，通过给定的检测步骤，获得阳性检测结果概率为x的测量分析物的含量。

示例：LOD5050%测试出阳性结果的检出水平。

3.11

相对检出水平relativelevelofdetection：RLOD

相同的样品，待确认方法和参考方法的检出水平（LODx）的比率。

3.12

估计LOD50estimatedLOD50

基于本标准中描述的实验设计方案测定LOD50（阳性结果检测概率为50%）。

注：由于测试样品的数量非常少，因此无法准确测定LOD50。因此，使用术语估计LOD50。

3.13

包容性inclusivitystudy

用待确认方法对纯化后的目标菌进行定性或定量检测的研究。

3.14

排他性exclusivitystudy

用待确认方法对纯化后的非目标菌进行的研究，这些非目标菌株可能具有交叉反应，但最终不会被待确认方法定性或定量。

3.15

特异性 specificity;SP

参考方法或待确认方法不能检测分析物的能力。

[ISO16140-1:2016.定义2.72]

3.16

准确度 accuracy

被测量的测得量值与其指定值之间的一致程度。

注1：概念“测量准确度”不是一个量，也不给出量的数值。当测量给出较小的测量误差，则测量更准确。

注2：术语“测量准确度”不宜用于表示“测量正确度”，“测量精密度”不宜用于表示“测量准确度”，尽管测最准确度与这两个概念有关。

注3：测量准确度有时被理解为赋予被测量的测得的量值之间的一致程度。

3.17

定量限 limitofquantification；LOQ

样品中的分析物能被定量测定的最低浓度，在此测试条件下的分析结果具有可接受的正确度和精密度。

[ISO16140-1:2016，定义2.36]

3.18

β-期望容忍区间β-expectationtoleranceinterval；β-ETI

预期一定比例的种群的数值范围。

注1：所述比例表示值落在分布的上限和下限之间的概率。

注2：随着样品大小的增加，容忍区间趋于固定值。

3.19

偏倚：bias

测量偏倚。系统测量误差的估计值，或定量结果的指定值与测量重复结果平均值之间的系统性差异。

3.20

估计偏倚estimatedbias

基于本标准中描述的实验设计方案测定的偏倚。

注：由于测试样品的数量非常少，因此无法准确确定偏倚。因此，使用术语估计偏倚。

3.21

精密度 precision

测量精密度。在规定条件下，对同一或类似被测对象重复测量所得示值或测得的量值间的一致程度。

注1：测量精密度通常用指定测量条件下的标准偏差、方差或变异系数来表示。

注2：“指定条件”可以是例如重复性测量条件，中间精密度条件或再现性测量条件（参见ISO5725-3).

注3：测量精密度用于定义测量重复性、中间测最精度和测量再现性。

注4：有时，“测量精密度”错误地用于表示测量准确度。

〔ISO16140-1：2016.定义2.51]

4 方法确认

4.1 总则

实验室应对其制定的方法、超出预定范围使用的标准方法、扩充和修改过的标准方法进行确认。确认应尽可能全面，以满足预期用途或应用领域的需要。对于确认过的方法，实验室应制定作业指导书。

实验室应按照技术方案先进行实验室内方法确认研究试验，然后，由协作实验室用相同的样品进行实验室间协同试验。可采用对待确认方法与参考方法进行比较研究的方式，对待确认方法的特性参数进行确认。

4.2 特性参撒的选择

实验室可在综合考虑成本、风险和技术可行性基础上，并根据预期的用途来进行方法确认。方法确认首先应明确检测对象特定的需求，包括样品的特征，数量等，并应满足客户的特殊需要，同时应根据方法的预期用途，选择需要确认的方法特性参数。典型的需要确认的方法特性参数见表l。

表1典型方法确认参数的选择

待评估性能参数

确认方法

筛选方法

定量方法

定性方法

定量方法

定性方法

相对检出水平

—

√

—

—

定量限

√

—

√

—

相对正确度

√

—

—

准确度

√

—

√

—

灵敏度

—

√

—

√

包容性和排他性

√

√

√

√

测量不确定皮

√

—

√

—

注：√表示正常情况下需要确认的特性参数；—表示正常情况下不需要确认的特性参数。

4.3确认方式

4.3.1实验室内方法确认

一般原则

实验室内方法确认是通过对待确认方法与参考方法进行比较研究的方式，对待确认方法的特性参数进行确认，从而证实该方法的适用性。

对于定性方法，至少需要确认的技术参数包括方法的相对检出水平、灵敏度、包容性和排他性。

对于定量方法至少应确认方法定量限、相对正确度、准确度、包容性和排他性、测量不确定度等技术参数。

测试样品的要求

实验室应根据方法规定预期用途，选择基质的种类和类型。测试样品应选择自然污染的样品，如果无法获得足够数量的自然污染样品，则允许使用人为污染样品。测试样品的基质，应包含不同含量的背景微生物（高含量，低含量）的样品，不同加工方式的样品，以及原始（未加工）的样品等。

示例1：如果待确认方法仅适用于某类基质，则只需对该类基质进行确认。如果待确认方法适用于多种基质，如食品，至少选择5类食品，其中每类食品选择不少于3种不同类型样品（如未加工食品、初加工食品及深加工食品等）进行测试研究，不同类型样品各20份。

示例2：对于定性方法，理想状态是每种类型样品中有10份是阳性样本，10份是阴性样本，至少对于每一类基质，应设置50%的阳性样本。全部阴性或阳性的样品水平是没有意义的。

4.3.2 实验室间方法确认

一般原则

实验室间方法确认是通过不同实验室使用相同的样品进行检测时，比较待确认方法和参考方法特性参数，并将这些结果与待确认方法和参考方法之间可接受差异的限定标准进行比较分析。实验室间方法确认通常由8个协同实验室完成。特殊情况下，至少由5个协同实验室完成。

测试样品的要求

由组织实验室制备统一的测试样品，并尽可能结合使用人工和自然污染样品。如没有自然污染样品，可以使用人工污染的样品。基质的选择参见。

对于定性方法每一种基质至少包括3个测试水平的样本，包括阴性对照和两个测试水平的阳性样品．至少有一个水平的样品设置为获得部分阳性的结果，依据概率分布，理论上，1个菌落形成单位(CFU）／样品的测试水平应获得30%的阴性结果。每个协同实验室需要对每个水平．采用两种方法．进行8次重复试验，即每个协同实验室至少提供48个结果数据（3个水平×2个方法×8次重复）。

对于定量方法，每一种基质至少包括3个测试水平，并涵盖方法的测试范围，采用两种方法，每个水平进行8次重复试验，每个样本至少2次重复，即每个协同实验室至少提供48对结果数据（96个结果）。组织实验室负责数据的统计分析，如有证据表明所获结果未严格按照检测方法或不满足检测条件要求，实验室应将该结果剔除。数据剔除后，不需要对离群值进行统计分析。

注1：参与实验室间方法确认的实验室，相关的或类似的检测项目建议通过ISO17025:2017认可或具有其他等同资质。

法2：用于实验室间方法确认的样本的数量及重复测试数的设计是基于检测方法与结果的准确度的考虑，详见GB/T6379.2。

4.4 特性参数的确认

4.4.1实验室内方法研究特性参数的确认

灵敏度

灵敏度测定的目的是确定参考方法和待确认方法之间的灵敏度差异。灵敏度试验的样品一般选择自然和／或人为污染的样品。每类基质种类选择不少于3种不同类型的样品，每个类型测试样品的数量不少于20份。

配对比较待确认方法与参考方法，分别按式(1）计算待确认方法（SEalt，）和按式（2）计算参考方法(SEref）的灵敏度，按式（3）计算待确认方法的相对正确度（RT）和式（4）计算假阳性率（FPR）。

式中：

PA一一阳性符合，即两个方法的阳性结果相一致；

PD一一阳性偏离，及待确认方法检出阳性结果，而参考方法为阴性结果；

ND一一阴性偏离，及待确认方法检出阴性结果，而参考方法为阳性结果；

N 一一样本总数（NA十PA+PD十ND);

FP一一假阳性结果。

配对和非配对研究的结果用于可接受性限（AL)的评估，分别计算阴性偏离（ND）和阳性偏离（PD)之差（ND-PD)配对研究的阴性偏离（ND）和阳性偏离（PD）之和（ND十PD)。方法确认研究的可接受性限（AL）可参考附录A的表A.1。当结果的计算值高于AL时，则确认结果不满足AL的要求。当AL不满足时，应对根本原因进行分析，对观察到的结果进行解释。根据AL和附件信息，确认待确认方法适用或不适用于所分析的基质种类或类别。

相对检出水平

检出水平（LODx）是预期可以检测到目标微生物的最低含量。在本标准中，使用LOD50对待确认方法和参考方法的检出水平CLODx）进行比较研究，并采用相对检出水平（RLOD）对待确认方法进行评估。

RLOD的研究采用人工污染样品的方式。每类基质种类可选择1种类型的样品，且至少三种污染水平，其中包括阴性对照，低水平和高水平。理想情况下，低水平应为理论检测水平（即每个测试部分为0.7CFU）高水平恰好高于理论检测水平（例如每个测试部分1CFU~1.5CFU）。对于阴性对照，应采

用待确认方法和参考方法测试至少五个重复样品。对于低水平至少检测20份重复样品，对于高水平，

应测试至少五个重复样品。阴性对照应为阴性结果，当获得阳性结果时，必须对所有水平重新测试。

RLOD定义为待确认方法和参考方法的检出水平（LODx）的比率，计算如式（5）所示：

....................(5)

式中

LODalt一一待确认方法的检出水平；

LODref一一参考方法的检出水平。

配对研究的可接受性限CAL）为1.5，即待确认方法的LODx不得高于参考方法的LODx的1.5倍。未配对研究的AL设定为2.5，即待确认方法的LODx不得高于参考方法的LODx的2.5倍。可以接受待确认方法的LODx值小于参考方法的LODx值，这表明待确认方法比参考方法可检测到的污染水平更低。

当结果的计算值高于AL时，则确认结果不满足AL的要求。当AL不满足时，应对根本原因进行分析，对观察到的结果进行解释。根据AL和附件信息，确认待确认方法适用或不适用于所分析的基质种类或类别。

包容性和排他性

.1 总则

包容性和排他性所使用的每株菌株应具有足够详细的生物化学和／或血清学和／或遗传学特征。对于定量方法，包容性和排他性测试适用于特定微生物的计数（例如，李斯特氏菌）．不适用于计数所有微生物总数的方法，例如菌落总数、霉商和酵母计数等。

.2 包容性

只需要使用待确认方法进行包容性测试，在测试过程中不需要添如样品基质。包容性测试，应测试至少50个（目标）微生物纯培养物。测试菌株的纯培养应是在最佳生长条件下，在非选择性培养基上培养并处于稳定期的细胞群体。接种水平应比已确认方法的最低检出水平高10倍至100倍。当包容性结果为阴性或可疑时，应同时用参考方法进行重复测试，分析相关菌株是杏可以用参考方法进行检测。

.3 排他性

只需要使用待确认方法进行排他性测试在测试过程中不需要添加样品基质。排他性测试，应测试至少30个（非目标）微生物的纯培养物。测试菌株的纯培养应是最佳生长条件下，非选择性培养基上培养并处于稳定期的细胞群体。如果待确认方法中有选择性增菌的步骤，为了排他性测试的目的，应使用非选择性培养基替代该步骤中所使用的选择性培养基。当排他性结果为阳性或可疑时应重复测试待确认方法，同时对参考方法进行测试，分析参考方法是否能检出相关菌株。

相对正确度

相对正确度研究是对参考方法的结果与待确认方法的结果之间的比较研究。使用自然和/或人工污染样品的方式进行。每类基质种类至少选择3种不同类型的样品，每个类型样品至少5个。所有样品的污染水平应覆盖微生物种类的浓度范围。

使用Bland-Altnan方法分析所获得的结果，计算待确认方法和参考方法的平均值和差值，偏倚可以用这两种方法测定结果的差值的平均值D进行估计，平均值D的变异情况则用差值的标准差Sd来描述。如果差值的分布服从正态分布，绝大多数差值都应位于偏倚的95%置信区间内。因此，如果两种测量结果的差异位于一致性界限内，是可以接受的。

准确度

准确度研究是通过参考方法的结果与待确认方法的结果之间的比较研究，使用人工污染样品的方式进行。每个类型样品共6个测试样品，其中2个样品为低浓度污染水平，2个为中间浓度污染水平，2个为高浓度污染水平，覆盖所选择的类型样品的整个污染范围。每个测试样品重复测试5次。

每个测试样品，采用两种方法，在重复条件下进行定量检测。将计数结果转换成对数，如果待确认方法的结果对数值（yi）被假定为符合正态分布，计算yi值的β-期望容忍区间（β-ETI）。

准确度的可接受性限设置为：AL-±0.5对数单位。绘制准确度分布图。容忍区间的上限和下限通过直线连接，以内插验证样本的不同水平之间的限制行为。水平线表示用参考方法获得的参考值。参考值和待确认方法的每个污染水平的平均值的差用墨点表示。当不存在偏倚时，这些值都位于水平参考线上。此外，可接受性限由两条水平虚线表示，β-ETI限以折线来表示。

对于所有的样本，其β-ETI的上限值≤AL和下限≥-AL，则认为待确认方法与参考方法等效。

定量限LOQ

只有待确认方法的测量原理不是基于对目标微生物的菌落行计数时，才需要确定定量限(LOQ）。例如，采用仪器法测定与微生物生长相关的电导率或荧光等。确定LOQ，需要用待确认方法测试每个基质种类的空白，相同的样品至少测试10个测试单元，结果用于估计基线或阔值的标准偏差S0。通常建议将空白值加上10倍的重复性标准偏差作为LOQ。

测量不确定度

需要时，可对微生物定量检测方法进行不确定度评估。

影响微生物定量分析结果的不确定度产生的因素有很多，如质量、体积、样品因素和非样品因素等。其中样品因素，如取样（从大量的待测样品中取出测试样品）是总误差来源的重要组成部分，但它并不是测量本身不确定度的组成部分。次级取样是指从测试样品（从大量样品中取出的单元）中取出检测的单元，微生物计数中的初始悬液的制备属于次级取样。而非样品因素则为分析过程（包括操作者、时间、设备、培养基和试剂等）。剩余的自由误差来源于以前来说明的因素，通常是在重复性条件下实验室内部进行评定时才给予考虑。因此根据微生物计数的经验，测量不确定度的评估一般不考虑偏倚。

对于微生物定量检测的测量不确定度评估可参考RB/T151一2016。

4.4.2实验室闽方法研究特性参数的确认

定性方法

测试样品应使用至少三种不同的污染水平：空白对照（L0）和两个水平（L1和L2）。

对于L0水平的结果，分别按式（6）计算参考方法和式（7）计算待确认方法的百分比特异性(SP）。

参考方法的特异性：

.............................................(6)

待确认方法的特异性：

............................................(7)

N_ 一一L。水平的阴性结果数量；

Po一一结果鉴定前空白对照样品获得的假阳性结果的数量；

CPo一一空白对照样品获得的假阳性结果的数量。

对于L1和L2水平的结果，计算待确认方法的灵敏度（SEalt）和参考方法的灵敏度（SEref),相对正确度（RT）和待确认方法的假阳性率（FPR）。

配对研究中，水平L1或L2中至少有一个水平应获得部分的阳性结果，计算该水平的阴性偏离(ND）和阳性偏离（PD）之差（ND-PD）和阴性偏离（ND）和阳性偏离CPD）之和（ND+PD），其结果值不应高于可接受性限值（ALs）。不同协作实验室数量与可接受性限（ALs）可参考表A.2。

非配对研究中，计算获得部分阳性结果的水平（L1或L2）的阴性偏离（ND）和阳性偏离（PD）之差(ND-PD）。（ND-PD）的值不应离子AL。AL值定义为[(ND-PD〕max］，其计算可参考ISO16140-2。

定量方法

计算结果的准确度，并绘制准确度分布图形。容忍区间限的上限和下限通过直线连接，以内插验证样本的不同水平之间的限制行为。水平线表示用参考方法获得的参考值。参考值和待确认方法的每个污染水平的平均值的差用黑点表示。当不存在偏倚时，这些值都位于水平参考线上。此外可接受性限由两条水平虚线表示，β-ETI限为折线来表示。

可接受性限制设置为士0.5对数单位。

对于所有污染水平，β-ETI的值位于可接受限度范围内时，该方法被认为与参考方法相当。

5方法验证

5.1总则

5.1.1在微生物检测实验室引入标准方法时，实验室应根据以下5.2~5.4所述，验证操作方法是否满足标准的要求，即证实该方法能在该实验室现有的设施设备、人员、环境条件下获得令人满意的结果，必要时可参加能力验证或进行实验室间比对。

5.1.2 如果只是对标准方法稍加修改，如使用不同制造商的同类设备或试剂等，必要时也应进行验证，以证明能够获得满意的结果，并将其修改内容制定成作业指导文件。

5.1.3如果发布机构修订了方法应在所需的程度上重新进行验证。

5.1.4 在进行方法验证之前，应参考标准方法或巴确认方法的适用范围，选择用于方法验证的基质种类。

5.2 特性参数的选择

实验室进行方法验证的内容包括但不限于以下方法特性：

a) 检出水平；

b) 估计偏差；

c) 精密度；

d) 测量不确定度。

方法验证应根据方法的预期用途．选择需验证的方法特性参数，典型需要验证的方法特性参数见表2。

表2方法验证参数的选择

待评估性能参数

定量方法

定性方法

检出水平

-

√

估计偏差

√

-

精密度

√

-

测量不确定度

√

-

注：√表示正常情况下需要验证的性能参数；-表示正常情况下不需要验证的性能参数

5.3定性方法

每种基质至少需要在高、中、低3个不同接种水平和无接种情况下完成测试，每种情况下测试两次，共得到8个测试结果。包括2个高水平：接种量时不超过预期LOD50的十倍；2个中水平：将高水平接种物稀释2倍得到中间水平接种物；2个低水平：将高水平接种物稀释10倍得到低水平接种物；2个无接种物，作为空白对照。

高水平的接种（10×LOD50)只能获得阳性结果，如果获得阴性结果，则应对应所有水平进行重复实验。空白对照不应获得阳性结果，如果获得阳性结果，则应对所有水平进行重复实验。

记录每个接种水平获得的阳性结果的数量，并使用附录B中表B.1确定评估的LOD50，并于方法确认研究中的LOD50进行比较，如果没有该方法的确认资料，则估计的LOD50应该≤3CFU/测试单元。

5.4定量方法

5.4.1估计偏差

选定用于方法验证的基质种类，定量方法的验证试验尽可能使用自然污染的样品。样品可以来自

不同的批次（不同的产品，不同的生产商等），以覆盖方法的测定范围。每个验证的基质种类需要测定3个不同批次，每个批次代表1个污染水平.3个污染水平应涵盖该方法的使用范围。根据污染水平以及目标微生物种类，如果样品测试单元的预期自然污染水平低于某限值，则建议使用人工污染的方式。

实验室使用参考方法（首选）或实验室当前使用的方法，作为对照方法与待验证方法同步进行试验。如果实验室没有可同步进行的对照方法，实验室应采用非选择性培养基计数培养物的浓度。

每个污染水平，待验证方法的计数结果与对照方法结果之间的差值在0.5lgCFU/g以内。

5.4.2精密度

定量分析的精密度仅表现为实验室内重复性。对于在重复性条件下进行的适当的测量数据．可用实验室内重复性标准偏差（sr）表示。

测试样品尽可能使用自然污染的物品，如果样品测试单元的预期自然污染水平低于10CFU/g，则使用人工污染的方式。重复性的测定通常需要测定10个以上的测试样品。将每个测试样品均质化并从该均质样品中取出两个测试单元，定义为测试单元A和测试单元B。

在验证方法规定的范围内，测试单元A和测试单元B的测试条件应尽量不同，应包括但不限于：

a) 技术人员；

b) 培养基和试剂；

c) 仪器（培养箱、涡榄混合器、移液器等）。

实验室内重复性标准偏差（sr）应小于或等于该方法在确认研究中给出的实验室间再现性标准偏差

(SR）。

5.4.3测量不确定度

如果参考方法对不确定度的主要影响因素贡献值和对结果的表达方式有要求，则实验室应该满足于同类标准的要求。

对于微生物定量检测的测量不确定度评估可参考RB/T151-2016。

附录 A

（资料性附录〉

定性方法确认中配对和不配对研究的可接受性限参数和限值

A.1 与样品种类数量精关的配对和不配对研究的可接受性限参数和限值

定性方法确认中，与样品种类数量相关的配对和不配对研究的可接受性限参数和限值，见表A.1。

表A.1 与样品种类数量相关的配对和不配对研究的可接受性限参数和限值

基质种类数量

配对研究

不配对研究

(NDa-PDb)

(ND十PD)

(ND-PD)

1

3

6

3

2

4

8

4

3

5

10

5

4

5

12

5

5

5

;)

14

5

6

6

16

6

7

6

18

7

8

6

20

7

ND——阴性偏离结果的样品数量；

PD——阳性偏离结果的样品数量。

注：可接受性限制（AL）基于数据和专家意见。AL不基于数据的统计分析。

A.2与协作实验室数量相关的配对研究的可接受性限参数和限值

实验室间方法确认过程中，与协作实验室数量相关的配对研究的可接受性限参数和限值，见表A.2。

表A.2 与协悻实验室数量相关的配对研究的可接受性限参数和限值

Nlab

(ND-PD)

（ND+PD)

10

3

4

11

4

4

12~13

4

5

14~16

4

6

17

4

7

18

5

7

19~20

5

8

11

附 录 B

（资料性附录〉

根据每个污染水平的阳性结果数量估算LOD50

根据每个污染水平的南性结果数量估算LOD50见表B.1。

表B.1 根据每个污染水平的阳性结果数量估计LOD

高水平的接种

（约10×LOD50／测试单元）

中间水平的接种

（约5×LOD50／测试单元）

低水平的接种

（约1×LOD50／测试单元〉

空白对照

估计LOD50

(CFU／测试单元〕

2/2

2/2

2/2

0／2

<l×LOD50

2/2

2/2

1/2

0／2

=l×LOD50

2/2

2/2

0／2

0／2

=2×LOD50

2/2

1/2

2/2

0／2

=2×LOD50

2/2

1/2

1/2

0／2

=3×LOD50

2/2

1/2

0/2

0／2

=4×LOD50

2/2

0／2

2/2

0／2

不可靠的结果

2/2

0／2

1/2

0／2

=5×LOD50

2/2

0／2

0／2

0／2

=8×LOD50

注：结果的组合不太可能在测试污染水平时发生，因此导致不可靠的结果。因此该测试应重复进行。

12

参 考 文 献

[1]ISO16140-1 食品链微生物学 第2部分：术语（Microbiologyofthefoodchain-method

validation-Part1:Vocabulary)

[2] RB/T151-2016 食品微生物定量检测的测量不确定度评估指南

〔3]BLAND.J.M.,ALTMAND.G.Statisticalmethodsforassessingagreementbetweentwomethodsofclinicalmeasurement.Lancet.1986,p.307-310.

中华人民共和国认证认可

行业 标 准微生物检测方法确认与验证指南

RB/T033一2020

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中国标准出版社出版友行北京市朝阳区和平墨西街用2号(100029)

北京市西城区三里河北街16号(10004日网址\h

总编，(010)68533533发行中心，（010)51780238

读者服务部：（010)68523946中国标准出版社秦垒岛印刷厂印刷各地新华书店经销

开本880×12301/16

2020年11月第一版

’导

印张1.25字数28千字

2020年11月第一次印刷

书号：155066?235666

其二价

21.00元

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