DB37/T 3802-2019 花生品种鉴定技术规程 SSR标记法

ICS65.020

B04

DB37

山东省地方标准

DB37/T3802—2019

花生品种鉴定技术规程SSR标记法

Protocolforidentifyingpeanutvariety—SSRmarkermethod

2019-12-24发布2020-01-24实施

山东省市场监督管理局发布

DB37/T3802—2019

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。

本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：山东省花生研究所。

本标准主要起草人：闫彩霞、单世华、赵小波、李春娟、王娟、苑翠玲、孙全喜、宋秀霞。

I

DB37/T3802—2019

花生品种鉴定技术规程SSR标记法

1范围

本标准规定了利用简单重复序列（Simplesequencerepeat，SSR）标记法进行花生（Arachis

hypogaeaL.）品种鉴定的术语与定义、仪器设备、试剂与溶液配制、引物信息、鉴定方法、数据读取

与判定方法。

本标准适用于花生品种的鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则

NY/T2237植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南花生

3术语与定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

简单重复序列simplesequencerepeat，SSR

由几个核苷酸（1～6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp（一般为100～200）的串联

重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其多态性主要来源于串联数目的不同。

3.2

推荐引物recommendedprimer

根据最少引物区分最多品种的原则筛选出的一套SSR引物，具有条带清晰、多态性高、重复性好、

均匀分布的特点，用于DNA分子数据的采集和品种鉴定。

3.3

参照品种referencevariety

具有推荐SSR位点上不同等位变异的花生品种，用于辅助确定送检样品的等位变异扩增片段的大小，

校正仪器设备的系统误差。

4仪器设备

1

DB37/T3802—2019

所用仪器设备见附录A。

5试剂、溶液配制及引物信息

5.1试剂及溶液配制

试剂及溶液配制见附录B（除特殊说明外，所用试剂均为分析纯）。

5.2引物信息

推荐引物的相关信息见附录C。

6鉴定方法

6.1样品准备

6.1.1样品为花生种子及其他植物组织。种子样品的分样和保存，按照GB/T3543.2的规定执行。

6.1.2每份样品中至少随机抽取10个个体，每个个体单独分析。如样品为种子，水培法种植，至第三

片真叶长出后备用。参照品种（见附录D）各种植2粒，混合分析。

6.2样品的DNA提取

6.2.1DNA提取

取花生幼嫩组织50mg，放入组织破碎仪中，液氮研磨。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取基

因组DNA，室温风干，加入100μL1×TE（pH8.0）溶液溶解DNA。完全溶解后每管加入5μLRNAase，

37℃温育1h，－20℃下保存留用。

6.2.2DNA浓度和质量检测

利用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，GoldView染料进行染色。测定DNA溶液的OD260/OD280值，

在1.8～2.0范围内最佳。测定其OD260的吸光度，以1个OD260值相当于50mg/LDNA浓度来计算DNA的浓度。

稀释至工作浓度为30ng/μL，置于4℃下备用。

6.3PCR扩增

6.3.1参照品种的使用

在进行PCR扩增和等位基因检测时，不同SSR引物的参照品种参见附录C。

6.3.2反应体系

总体系为10μL，包括4.5ng/μLDNA，0.8μmol/LF/R引物，1×DreamTaqGreenPCRMaster

Mix，1.9μL蒸馏水，混匀。

6.3.3反应程序

95℃预变性3min；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，进行35个循环；72℃延伸

5min；4℃下保存备用。

6.4PCR产物检测

2

DB37/T3802—2019

6.4.1玻璃板组装

清洗玻璃板和样品梳，晾干。用无水乙醇擦拭凹板和平板各2遍，待玻璃板彻底干燥后，将1.0mm

厚的塑料边条整齐摆放在平板两侧，盖上凹板，对齐，夹紧，用水平仪调平。

6.4.2制胶

根据凝胶的面积和数量，调整6%聚丙烯酰胺凝胶溶液的用量，分别加入1‰的APS和1‰的TEMED，

轻轻摇匀，防止产生气泡，迅速灌胶。待胶液充满玻璃板夹层，在上部凹面处轻轻插入样品梳平端，深

度约0.8cm。室温下静置1h，使胶液聚合，如室温较低可适当延长聚合时间。

6.4.3电泳准备

将制好的胶板固定于垂直电泳槽上，凹板向内。上下槽中各加入1×TBE缓冲液，至下槽液面约为槽

高的1/3，上槽液面高于玻璃板凹面约1cm。拔去梳子，冲洗胶孔，清除底层气泡和杂质。将样品梳齿

端插入凝胶1mm～2mm处。

6.4.4上样

PCR产物中加入1/6体积的6×loadingbuffer，微量移液器上样，每孔加入2μLPCR扩增产物（上

样量可根据加样孔的大小适当调整）。20bpDNALadder分子量标记加入两侧加样孔中，对应参照品种

的PCR产物加入中间加样孔中，检测样品PCR产物加入其余加样孔中。

6.4.5电泳

电压为200V，根据指示剂位置调整时间，至青蓝色的二甲苯青指示带到达胶板底部，停止电泳，

电泳时间一般为2h。

6.5银染显色

6.5.1水洗

电泳结束后，分开两块玻璃板，取出凝胶，用蒸馏水快速漂洗2次，不超过10s。

6.5.2银染

将凝胶转移至适量染色液中，使其完全浸没，在摇床上轻摇10min。

6.5.3水洗

将凝胶从染色液中取出，在蒸馏水中快速漂洗2次，时长8s～10s。

6.5.4显影

将凝胶转移至适量显色液中，使其完全浸没，在摇床上轻摇至带纹清晰。

6.5.5漂洗

将凝胶转移到蒸馏水中清洗，直至蒸馏水澄清。

6.6成像

将凝胶置于凝胶成像系统的工作台上，选用透射紫外光观察，调节至图像最清晰，保存。

3

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7数据读取与判定方法

7.1数据读取

利用凝胶分析软件Quantityone读取条带，每个SSR位点的等位变异大小用扩增片段长度表示，单

位为bp。与对应的参照品种进行比较，校正系统误差，确定送检样品在每个位点的等位变异大小，获得

送检样品27个SSR位点的指纹图谱。

7.2判定方法

根据送检样品与相应品种指纹图谱的差异位点数，对送检样品进行鉴定。

——当送检样品与相应品种指纹图谱的差异位点数≥2，则判定为“不同品种”；

——当差异位点数=1，判定为“近似品种”；

——当差异位点数=0，判定为“疑同品种”。

对于差异位点数≤1个的送检样品，应按GB/T19557.1给出的原则和NY/T2237给出的方法进行田间

测试，确定送检样品在表型性状上是否与对应品种一致。

4

DB37/T3802—2019

AA

附录A

（规范性附录）

仪器设备

A.1组织破碎仪

温控范围为－40℃～室温。

A.2高压灭菌锅

灭菌温度为105℃～136℃，最大工作压力为0.22MPa。

A.3凝胶成像系统

分辨率不低于400百万像素。

A.4高速冷冻离心机

最大离心力不小于15000g。

A.5PCR扩增仪

控温范围为0℃～100℃。

A.6紫外可见分光光度计

波长范围为190nm～1100nm。

A.7恒温水浴锅

温度范围为室温～99℃。

A.8水平摇床

转速为0rpm～230rpm。

A.9微波炉

最高耐温120℃。

A.10电子天平

5

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精确到0.01g。

A.11电泳槽

样品通量为1.0mm厚。

A.12磁力搅拌器

转速为0r/min～2500r/min，控温范围为室温～100℃。

A.13酸度计

测量范围为0.00pH～14.00pH。

A.14微量移液器

量程分别为2µL、10µL、100µL、200µL、500µL和1000µL。

6

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BB

附录B

（规范性附录）

试剂及溶液配制

B.1试剂

B.1.1乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na2）。

B.1.2三羟基甲基氨基甲烷（Tris）。

B.1.3盐酸（HCl，36%）。

B.1.4十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）。

B.1.5氯化钠（NaCl）。

B.1.6硼酸（Borate）。

B.1.7丙烯酰胺。

B.1.8甲叉双丙烯酰胺。

B.1.9四甲基乙二胺（TEMED）。

B.1.10无水乙醇。

B.1.11过硫酸铵（APS）。

B.1.12硝酸银（AgNO3）。

B.1.13琼脂糖。

B.1.146×loadingbuffer。

B.1.15GoldView染料。

B.1.16RNAase（10mg/mL）。

B.1.17酚:氯仿:异戊醇（体积比25:24:1）。

B.1.18异丙醇。

B.1.19四硼酸钠。

B.1.20甲醛。

B.1.212×DreamTaqGreenPCRMasterMix。

B.1.22SSR引物（10μmol/L）。

B.1.2320bpDNALadder。

B.1.24重蒸水或符合GB/T6682规定的一级水.

B.2溶液配制

B.2.11mol/LNaOH

4gNaOH，加蒸馏水定容至100mL。

B.2.21mol/LTris-Cl（pH8.0）溶液

称取121.1gTris，加蒸馏水定容至1L，浓盐酸调至pH8.0，高压灭菌备用。

B.2.30.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液

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称取186.1gEDTA-Na2，800mL蒸馏水，加热定容至1L，1mol/LNaOH调至pH8.0，高压灭菌备用。

B.2.41×TE

1mL1mol/LTris-HCl（pH8.0），0.2mL0.5mol/LEDTA（pH8.0），加蒸馏水定容至100mL。

B.2.5DNA提取液

4gCTAB，16.364gNaCl，20mL1mol/LTris-Cl（pH8.0），8mL0.5mol/LEDTA（pH8.0），

加蒸馏水定容至200mL，4℃条件下保存。使用前加入2%的巯基乙醇，实验前预热至65℃。

B.2.670%乙醇

700mL无水乙醇，加蒸馏水定容至1L。

B.2.710×TBE缓冲液

分别称取108g三羟基氨基甲烷，55g硼酸，加入800mL蒸馏水加热溶解，再加入0.5mol/LEDTA

（pH8.0）溶液37mL，加蒸馏水定容至1L。

B.2.81×TBE缓冲液

100mL10×TBE，加蒸馏水定容至1L。

B.2.910%APS

0.5gAPS溶于5mL蒸馏水中。

B.2.106%聚丙烯酰胺凝胶溶液（29:1）

分别称取58g丙烯酰胺，2g甲叉双丙烯酰胺，100mL10×TBE，加蒸馏水定容至1L，4℃条件下

保存。

B.2.11染色液

称取1g硝酸银，加蒸馏水定容至1L。

B.2.12显色液

6gNaOH，0.2g四硼酸钠，1.6mL甲醛，加蒸馏水定容至400mL。

8

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CC

附录C

（资料性附录）

推荐引物

推荐引物见表C.1。

表C.1推荐引物

引物连锁群引物序列（5′→3′）常见等位变异（bp）参照品种

160zh.h2461

162zh.h5075

164zh.h2406

166zh.h1961

F-tcggtttgggagacactctt

Ah1TC5A06A07168zh.h0949

R-ttgtaagcagacgccacatc

172zh.h2250

176zh.h2405

180zh.h2764

188zh.h0537

168zh.h2413

174zh.h2499