DB4403/T 122-2020 人源肿瘤细胞系建立技术规范

ICS07.080

CCSC04

DB4403

深圳市地方标准

DB4403/T122—2020

人源肿瘤细胞系建立技术规范

Technicalspecificationforestablishmentofhumantumorcelllines

2020-11-23发布2020-12-01实施

深圳市市场监督管理局发布

DB4403/T122—2020

目次

前言................................................................................II

1范围...............................................................................1

2规范性引用文件.....................................................................1

3术语和定义.........................................................................1

4缩略语.............................................................................3

5样本获取...........................................................................3

6细胞建系...........................................................................4

7质量检测...........................................................................6

附录A（资料性）捐赠者基本信息表.....................................................9

附录B（资料性）肿瘤样本信息表......................................................10

附录C（资料性）主要仪器耗材列表....................................................11

附录D（资料性）细胞传代操作流程....................................................13

附录E（资料性）同工酶分析操作流程..................................................14

附录F（资料性）肿瘤细胞特异性标记物列表............................................16

附录G（资料性）台盼蓝染色标准流程..................................................17

附录H（资料性）凝集试验操作流程....................................................19

参考文献............................................................................20

I

DB4403/T122—2020

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起

草。

本文件由深圳市发展和改革委员会提出和归口。

本文件起草单位：深圳华大生命科学研究院、深圳市标准技术研究院。

本文件主要起草人：岳建辉、马启旺、樊阳波、李睿、叶晶晶、黎泽龙、何娜、侯勇、王博、张曦、

何旭珩、李启沅、陈振家。

II

DB4403/T122—2020

人源肿瘤细胞系建立技术规范

1范围

本文件确立了人源肿瘤细胞系建立过程中样本获取、细胞建系以及质量检测的操作程序和一般原

则。

本文件适用于人源实体肿瘤细胞系相关研究。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB18467献血者健康检查要求

YY/T0588流式细胞仪

SZDB/Z238短串联重复序列基因分型法鉴定人源细胞系技术规范

ISCN2013人类细胞遗传学国际命名体制

ASN—0003—2015基于线粒体细胞色素氧化酶亚基1（CO1）DNA条形码鉴定动物细胞种属(Species

—LevelIdentificationofAnimalCellsthroughMitochondrialCytochromeOxidaseSubunit1(CO1)

DNABarcodes）

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

供体donor

提供肿瘤样本的捐赠者。

3.2

原代细胞primarycell

直接由获取的人体组织或器官制备形成的细胞。

3.3

细胞系cellline

由原代细胞群经传代培养获得的细胞群。该细胞群通常是非均质的，且具有明确的特性，可供建库

用。

1

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3.4

实体瘤solidtumor

机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致异常增

生而形成的新生物。

3.5

平衡盐溶液balancedsaltsolution

组织细胞培养时常用的基本液体，可以维持细胞的渗透压、调节pH值以及提供细胞生存所需的无机

离子成分。

注：常用于细胞、组织的洗涤。

3.6

密度梯度离心densitygradientcentrifugation

用一定的介质（如氯化铯、蔗糖和多聚蔗糖）在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，将细胞混

悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离的方法。

3.7

倍增时间doublingtime

在细胞培养过程中，对数期中细胞数量增加一倍所需的时间。

3.8

成瘤性tumorigenicity

细胞接种动物后在注射部位和（或）转移部位由接种细胞本身形成肿瘤能力。

3.9

染色体chromosome

遗传信息的载体，由DNA、RNA和蛋白质构成的，其形态和数目具有种系的特性。

注：在细胞间期核中，以染色质丝形式存在。在细胞分裂时，染色质丝经过螺旋化、折叠、包装成为染色体，为

显微镜下可见的具不同形状的小体。

3.10

同工酶分析isoenzymeanalysis

具有相似或相同特异性的酶，利用琼脂糖凝胶电泳技术，研究细胞裂解过程中同工酶的迁移规律，

以获得具有物种特异性的同功酶谱的过程。

3.11

核型分析karyotypeanalysis

2

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将待测细胞的染色体按照固有的染色体形态特征和规定，进行配对、编号和分组，并进行形态分析

的过程。

3.12

聚合酶链式反应polymerasechainreaction

通过DNA互补双链解链、退火和聚合延伸的多次循环来扩增DNA特定序列的方法。

3.13

流式细胞术flowcytometry

对悬液中的单细胞或其他生物粒子，通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和

分选的技术。

3.14

免疫荧光技术immunofluorescencetechnique

将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞分布的方法。

3.15

细胞半数致瘤量50%tumorproducingdose

能使50%动物产生肿瘤的最低移植细胞量。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

BPV：牛细小病毒（Bovineparvovirus）

CMV：巨细胞病毒（Cytomegalovirus）

DMSO：二甲基亚砜(DimethylSulfoxide)

DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）

EBV：人类疱疹病毒四型（Epstein—Barrvirus）

EDTA：乙二胺四乙酸（EthylenediaminetetraaceticAcid）

HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）

HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）

HIV：人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）

HTLV：人类嗜T细胞病毒（HumanT—lymphotropicVirus）

PBS：磷酸盐缓冲溶液（PhosphateBufferSaline）

PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）

PPV：猪细小病毒（PorcineParvovirus）

RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）

5样本获取

5.1伦理审批和知情同意

3

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5.1.1样本采集前应进行相应的准备工作，严格设计样本采集方案，并按照样本采集方的伦理审查要

求对方案的生物安全、伦理以及科学性进行审查。

5.1.2样本采集应遵循“知情同意、自愿”的原则。工作人员（包括医生、样本操作技术人员等）应

与捐赠者沟通，详细讲解项目背景、意义，采集的样本量、用途、潜在风险以及捐赠的权利、义务

等，获得捐赠者或者其法定代理人的知情同意。

5.2信息收集

5.2.1样本采集前应收集捐赠者信息，包括但不限于姓名、年龄、性别、住院号、病历号等基本信息

及既往病史、家族史、用药史、过敏史等临床信息。捐献者基本信息表参见附录A。

5.2.2样本采集后应详细记录所采集的肿瘤样本信息，包括但不限于样本的采集时间、编号、大小、

数量、采集人员等。肿瘤样本信息表见附录B。

5.2.3应建立严格有效的样本捐献者信息保护制度，对捐献者健康信息的隐私权加以保护。

5.3供体筛选

5.3.1用于肿瘤细胞分离培养的组织应进行筛选，宜排除下列情况的供体：

——病理类型为混合型；

——人源特定病毒检测结果不符合GB18467的规定；

——有精神障碍；

——伴有其他免疫性疾病，或长期应用免疫抑制剂或激素；

——医生认为其他不适合情况。

5.4样本采集前准备

5.4.1采集前应对样本进行编码，打印合适数量不易脱落、标注清晰的标签。仔细核对捐赠者信息，

确定无误后将标签粘贴在无菌的样本采集容器上。

5.4.2采集前应先准备所需的仪器、试剂和耗材，并确认仪器可以正常使用。主要仪器耗材列表见附

录C。

5.5样本采集

5.5.1实体瘤样本

5.5.1.1样本应首先满足捐赠者的诊断和治疗需求，剩余样本才能用于建立肿瘤细胞系。

5.5.1.2应采集具有典型生物学特征的肿瘤组织、癌旁组织和正常组织，实体瘤样本的直径宜不低于

5mm。

5.5.2胸腹水样本

当胸腹水样本中存在较多肿瘤细胞时，可在无菌条件下抽取胸腹水，采集量宜不低于20mL。

5.6样本保存与运输

5.6.1实体瘤样本应保存于含400IU/mL抗生素的培养基中。胸腹水样本可直接收集至样本保存瓶。

5.6.2实体瘤样本保存和运输时间应不超过12h，运输温度4℃～10℃。胸腹水样本处理保存与运输

时间应不超过2h。

6细胞建系

4

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6.1细胞分离

6.1.1总则

实体瘤样本宜选择组织块法或酶消化法进行原代细胞分离。

6.1.2组织块法

6.1.2.1充分去除血液、脂肪、神经组织及坏死组织，加入4℃平衡盐溶液清洗肿瘤组织。

6.1.2.2宜采用无菌眼科剪将肿瘤组织切成1mm3～2mm3大小的组织块。

6.1.2.3将约20个组织块转移至T25细胞培养瓶中，轻轻翻转培养瓶使其底部朝上，置于37℃、5%

浓度二氧化碳培养箱中培养2h～4h。

6.1.2.4将培养瓶轻轻平放，加入完全培养基，置于培养箱中继续培养。

6.1.3酶消化法

6.1.3.1充分去除血液、脂肪、神经组织及坏死组织，加入4℃平衡盐溶液清洗肿瘤组织。

6.1.3.2采用无菌眼科剪将肿瘤组织切成1mm3～2mm3大小的组织块。

6.1.3.3加入1mL～3mL0.25%胰蛋白酶或200IU/mL胶原蛋白酶，37℃水浴震荡消化0.5h～1h，或

4℃过夜消化。

6.1.3.4加入3mL～5mL完全培养基终止消化，采用孔径100μm的细胞筛网过滤，收集细胞悬液并

计数。

6.1.3.5以4℃，200g～300g的转速离心5min～10min后，除去上层清液，加入适量完全培养基，

调整细胞密度至0.5～1×106/mL，接种至培养瓶中，置于37℃，5%浓度二氧化碳培养箱内进行培养。

6.1.4胸腹水样本宜采用直接离心法，以4℃，300g～500g的转速离心5min～10min，收集肿瘤细

胞后直接进行培养。

6.2细胞培养

6.2.1肿瘤细胞培养初期，培养瓶应轻拿轻放，避免组织块和细胞脱落。

6.2.2细胞培养12h～72h，待细胞贴壁后进行首次换液，去除脱落的组织块和未贴壁细胞。

6.2.3每隔2天～3天换液，通过显微镜观察记录细胞生长状态。待细胞融合度达到80%以上时，可进

行细胞纯化和传代。

6.3细胞纯化

6.3.1肿瘤细胞的纯化宜采用机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、密度梯度离心法中的一种或多

种方法联合。

6.3.2机械刮除法

6.3.2.1显微镜下观察细胞，采用标记笔在培养瓶背面标记具有典型生物学特征的肿瘤细胞生长区域。

6.3.2.2弃掉培养液，显微镜下采用无菌细胞刮刮除无标记区域的杂细胞；采用平衡盐溶液清洗杂细

胞，加入培养液继续培养。

6.3.3反复贴壁法

6.3.3.1参考附录D细胞的传代操作流程中的步骤E.3.1—E.3.6收集细胞，接种至新的培养瓶中培养

5min～20min。

5

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6.3.3.2收集未贴壁的肿瘤细胞悬液，接种至新的培养瓶中培养5min～20min。

6.3.3.3重复步骤6.3.3.21次～3次，收集最后一次肿瘤细胞悬液，接种至新培养瓶中培养。

6.3.4消化排除法

6.3.4.1针对不同类型的细胞，采用