DB23/T 3234-2022 野生越桔根际土壤可培养细菌、真菌资源调查技术规程

ICS65.020.01

CCSB05

DB23

黑龙江省地方标准

DB23/T3234—2022

野生越桔根际土壤可培养细菌、真菌资源

调查技术规程

2022-05-25发布2022-06-24实施

黑龙江省市场监督管理局发布

DB23/T3234—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由黑龙江省林业和草原局提出。

本文件起草单位：黑龙江省林业科学研究所、东北林业大学、黑龙江省克东县森林病虫害防治检疫

站、黑龙江省林业和草原局调查规划设计院、黑龙江省庆安国有林场管理局苗圃、黑龙江省海伦市双河

林场。

本文件主要起草人：李丽丽、杨洪一、李向东、孙国芝、关大伟、崔崧、周志军、刘忠玲、李佳一、

郜宪宇。

I

DB23/T3234-2022

野生越桔根际土壤可培养细菌、真菌资源调查技术规程

1范围

本文件规定了野生越桔(Vacciniumvitis-idaeaL.)根际土壤可培养细菌、真菌资源调查的野外调查、

微生物分离纯化、微生物鉴定及结果、调查结果和调查档案。

本文件适用于野生越桔根际土壤可培养细菌、真菌的资源调查。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

NY/T1736—2009微生物肥料菌种鉴定技术规范

3术语与定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4野外调查

4.1工具与器材

定位仪、采集刀（铲）、冰盒、纸袋、塑封袋、记录本、记录笔、标签、数码相机、测绳（100m）、

手摇皮尺（100m）、钢卷尺（5m）、枝剪、捆绳、天平、铁锹、土壤环刀、土壤铝盒等。

4.2调查对象

通过查阅资料、实际踏查，了解调查地区野生越桔分布状况、生态类型及其伴生植被种类，选定调

查区域及不同群落的野生越桔作为调查对象。

4.3调查内容

野生越桔的生物学特性及生境信息（见附录A）、根际土壤样品采集。

4.4调查方法

4.4.1野生越桔的生态学特性及生境调查

采用样方调查法。选择代表性植物群落，在结果期进行调查采样。随机设置3个5m×5m的样方，

各样方间距离大于10m。记录样方的经纬度、海拔高度及伴生植被种类等，拍摄生境数码照片。每个

样方随机选取5株生长良好的越桔，分别测量其植株高度、基径等指标，作为样方的基础数据。

剪去地上植物，利用直径5cm的土钻分0cm～10cm、11cm～20cm、21cm～30cm三层收集土

壤样品，五点取样并混合，室内风干，过2mm筛后保存。

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4.4.2根际土壤样品采集

采用五点采样法。选取样方内正常生长的越桔植株，去除地上腐殖质及表层土壤，顺着植株主根进

行挖掘，采集5cm～30cm土层的越桔根部，轻轻去掉根系表面附着物及大块土壤，不应伤到根系，轻

轻抖落根部附着土壤，未抖落的留存土为根际土，用无菌毛刷收集根际土。收集时带一次性橡胶手套。

五份根际土壤混合放入无菌封口袋中，附上标签，记录采样信息。将取得土样立即放入冰盒保存，带回

实验室4℃冰箱保存。

5微生物分离纯化

5.1越桔根际土壤可培养细菌分离与纯化

5.1.1细菌分离与纯化培养基

根际土壤可培养细菌分离与纯化培养采用营养肉汤培养基，按附录B中B.1规定执行。固氮菌分

离与纯化培养采用Ashby无氮培养基，按附录B中B.2规定执行。放线菌分离与纯化培养采用高氏一

号培养基，按附录B中B.3规定执行。

5.1.2细菌分离与纯化方法

采用稀释平板涂布法分离、纯化。取1g根际土壤（干重），按附录C规定执行，置于内含玻璃珠

和99mL无菌水的锥形瓶中，180rpm震荡30min，制成土壤悬浊液。取土壤悬浊液1mL，采用连续

稀释法配成浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的土壤悬浊液。取浓度梯度为10-4、10-5、10-6的土

壤悬浊液，每一浓度吸取100μL，涂布于固体培养基，每一浓度重复涂布3次。细菌在37℃培养48h。

观察菌落的大小、形状、质地、边缘、隆起、颜色、光泽、透明度。放线菌在28℃培养5d～10d，观

察菌落的大小、形状、气生菌丝及基内菌丝的颜色。将不同形态的菌落在新的平板上反复纯化培养，直

至平板上菌落表面形态特征相同并出现单菌落。挑取细菌培养物进行简单染色或革兰氏染色，显微镜下

观察菌体形态。菌落和菌体形态一致者，标志着培养物符合要求。

5.2根际土壤可培养真菌分离与纯化

5.2.1真菌分离与纯化培养基

根际土壤可培养丝状真菌分离与纯化培养采用PDA培养基，按附录B中B.4规定执行。酵母菌分

离与纯化培养采用麦芽汁琼脂培养基，按附录B中B.5规定执行。

5.2.2真菌分离与纯化方法

采用稀释平板涂布法分离、纯化。取植物根际土壤1g（干重），按附录