DB5306/T 71-2021 昭通市马铃薯品种真实性和种薯纯度鉴定DNA分子标记

ICS65.020.20

B00

DB5306

昭通市地方标准

DB5306/T71—2021

昭通市马铃薯品种真实性和种薯纯度鉴定

DNA分子标记

2021-03-31发布2021-04-16实施

昭通市市场监督管理局发布

DB5306/T71—2021

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出的规

则起草。

本文件由昭通市农业科学院提出。

本文件由昭通市农业农村局归口。

本文件起草单位：昭通市农业科学院、云南师范大学。

本文件主要起草人：李周、胡祚、李灿辉、刘小红、杨健康、王韵雪、李志芹、余进隆、李怀龙、

肖德琴、杨菊、王晓娇。

I

DB5306/T71—2021

昭通市马铃薯品种真实性和种薯纯度鉴定DNA分子标记

1范围

本文件规定了昭通市DNA分子标记鉴定马铃薯（SolanumtuberosumL.）品种的方法。

本文件适用于昭通市马铃薯品种真实性鉴定和种薯纯度检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用

于本文件。

GB18133马铃薯种薯

GB/T28660马铃薯种薯真实性和纯度鉴定SSR分子标记

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1毛细管电泳

是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。

3.2DNA分子标记

能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。

3.3标准品种

取得中华人民共和国农业农村部非主要农作物品种登记证书的马铃薯品种。

4仪器用具、试剂和软件

4.1仪器及用具

——PCR仪（96孔，梯度）

——低温高速离心机（4℃，16000rpm/min）

——冰箱（-20℃，-80℃）

——制冰机(200kg-300kg/天)

——高压灭菌器（121℃，0.15MPa）

——微量移液器（0.5μL～10μL、10μL～100μL、100μL～1000μL）及配套的枪头

——凝胶成像仪

1

DB5306/T71—2021

——电泳仪

——水平电泳槽

——基因分析仪（GeneticAnalyzer,ABI3500/3730xl系列）

——紫外可见分光光度计（190nm-1100nm）

——0.2mLPCR管

——96孔测序板

——石英比色皿

4.2试剂

——常用贮备液制备方法见附录A

——DNA提取试剂制备方法见附录B

——DNA分子标记引物见附录C

——TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）和配套的PCR缓冲液

——1000bpDNAMarker

——无DNA酶的RNA酶A（DNase-freeRNaseA）（10mg/mL）

——异丙醇

——乙醇（70%）

——灭菌双蒸水（ddH2O）

——甲酰胺（HIDI）

——分子量内标（GeneScan500LIZ）

——核酸染料

4.3软件

——DataCollection4.0（ABI）

——GeneMarker2.09（ABI）

——GeneMapper4.0（ABI）

——MicrosoftExcel（Microsoftcorporation）

5供试材料

5.1取样：按照GB18133取样所述方法进行，采集大田植株叶片或块茎作为检测样品。

5.2样品保存：选取适量样品，装入冻存管，液氮速冻，置冰箱（-80℃以下）中保存备用（有效保存

期小于等于6个月）。

6鉴定程序

6.1总DNA提取

6.1.1称取100mg待测样品，置于预冷2.0mL离心管中，液氮冷冻下迅速研磨成细粉。

6.1.2依次加入700μL的两倍十六烷基三甲基溴化铵缓冲液（CTAB缓冲液）（见附录B表B.1）和2μL

的β-巯基乙醇涡旋混匀，置65℃水浴1h，期间每隔10min摇动混匀一次。

6.1.3冰上冷却约10min后，加入700μL的氯仿：异戊醇（24:1）混合液（见附录B表B.2），涡旋混

合，轻缓颠倒混匀数次。

2

DB5306/T71—2021

6.1.412000rpm离心5min，吸取上层水相至新1.5mL离心管中，加入等体积（400μL～500μL）的预冷

异丙醇，轻缓颠倒混匀。

6.1.54℃冰箱静置30min后，12000rpm离心15min，弃上清液。

6.1.6向离心管中加入70%乙醇1.0mL，静置3min后，12000rpm离心20min。

6.1.7小心倒出70%乙醇，再加入90%乙醇1.0mL，静置5min后，12000rpm离心10min，小心倒去乙

醇。

6.1.8在干净的吸水纸上倒置离心管，自然干燥15min。

6.1.9加入100μL的1×TE缓冲液，将十倍三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液（EDTA缓冲液）（见

附录B表B.3）稀释10倍并灭菌溶解DNA，再加入2μL的无DNA酶的RNA酶A（10mg/mL），37℃

温浴1h去除RNA，4℃冰箱放置备用。

6.2总DNA质量检测

6.2.1取DNA提取液1.0μL-5.0μL于新的1.5mL离心管中，加入1×TE缓冲液稀释至1.0mL，混匀后

转入石英比色皿中，用紫外分光光度计测定OD260和OD280下的光密度值（OD260：紫外光260nm下的

光密度值；OD280：紫外光280nm下的光密度值）。用OD260/OD280比值判断DNA纯度，比值在1.8～

1.9之间表明DNA纯度较高。按公式（1）计算提取液中DNA浓度。

OD260t50

dsDNA......................................................................(1)

1000

式（1）中：

dsDNA：双链DNA分子的含量（μg/mL）

OD260：紫外光260nm下的光密度值

t：稀释倍数

6.2.2总DNA浓度确定后，用1×TE缓冲液将所提取的总DNA稀释为终浓度50ng/μL，根据每次用量

分装，置-20℃冰箱保存备用。

6.3PCR反应

6.3.1PCR反应体系

在冰盘中或4℃条件下，按表1所列成分及其用量，顺序依次加入PCR管，准备25.0μLPCR反应

体系。

表1PCR反应体系

成分用量

ddH2O16.1μL

10×PCR缓冲液2.5μL

dNTPs(10mM)2.0μL

正向引物(10μM)