DB12/T 648-2016 黄瓜品种纯度SSR分子标记检测方法

ICS67.050

B31

DB12

天津市地方标准

DB12/T648—2016

黄瓜品种纯度SSR分子标记检测方法

MethodsofidentifyingvarietalpurityofcucumberbyusingSSR-basedmarkers

2016-09-27发布2016-11-01实施

天津市市场和质量监督管理委员会发布

DB12/T648—2016

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由天津市农村工作委员会提出。

本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、天津市蔬菜研究中心。

本标准主要起草人：兰青阔、张桂华、王惠哲、赵新、王成、崔兴华、朱珠、陈锐、徐石勇。

本标准2016年9月首次发布。

I

DB12/T648—2016

黄瓜品种纯度SSR分子标记检测方法

1范围

本标准规定了黄瓜品种纯度SSR分子标记检测方法的术语和定义、检测方法、纯度计算方法。

本标准适用于黄瓜单交种的纯度检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本

文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T2474黄瓜品种鉴定技术规程SSR分子标记法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

品种纯度VarietiesPurity

品种纯度指种子在SSR分子标记带型方面典型一致的程度，用具有本品种特异带型的种子粒数占

检测样品种子粒数的百分率表示，以反映某品种特征特性的一致性程度。

3.2

聚合酶链式反应PCR（PolymeraseChainReaction）

一种在体外通过酶促反应扩增特异DNA片段的技术。

3.3

简单重复序列SSR（SimpleSequenceRepeat）

由几个核苷酸（1-6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp（一般为100-200bp）的串

联重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。

3.4

分子标记MolecularMarker

以蛋白质、核酸分子的多态性为基础，检测生物在遗传上的差异。

4原理

1

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SSR分布于黄瓜整个基因组，每个位点上重复单位的数目不同造成了品种间的多态性，利用PCR

技术将多态的SSR扩增出来，通过电泳检测扩增产物，利用电泳图谱进行黄瓜品种纯度检测。

5仪器设备及试剂

5.1仪器设备

PCR仪；测序电泳槽；水平电泳槽；高压电泳仪（3000V，400mA，400W）；万分之一电子天

平；微量加样器；磁力搅拌器；台式离心机；紫外-可见成像系统；胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌

锅；pH计等。

5.2试剂

乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl，36%）；十二烷基

硫酸钠（SDS）；氯化钠（NaCl）；氢氧化钠（NaOH）；硼酸；去离子甲酰胺；溴酚蓝；二甲苯青

FF；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺；尿素；亲和硅烷；剥离硅烷；无水乙醇；四甲基乙二胺（TEMED）；

过硫酸铵；冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液（37%）；TaqDNA聚合酶（含Mg2+的10×PCR缓冲液）；四

种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）；SSR引物；琼脂糖；GoldView染料；实验用水为重蒸馏水或符合GB/T

6682规定的一级水等。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂。

5.3溶液配制

相关溶液配制方法见附录A。

6方法步骤

6.1取样

按照GB/T3543.2规定方法扦样，从送检样品中随机取10g种子，分别随机取其亲本种子10粒。

6.2单粒种子的DNA提取

6.2.1样品预处理

在玻璃培养皿底部垫上一层厚度适宜的棉花，用自来水浸湿后均匀地撒上种子，再于表面覆盖一

层纱布，置于光照培养箱中。培养条件为16小时28℃光照培养，8小时22℃暗培养，待种子长出子叶后

备用。也可采用经验证的、等效的培养条件。

6.2.2DNA提取

取单株幼苗子叶，放入1.5mL离心管中，在液氮中研碎，放入1.5mL离心管中。将DNA提取液预

热到65℃，每管放入400µL混合样品，将离心管置于65℃金属浴或水浴锅中，保温30min后取下，向

离心管中加入400µL24:1氯仿-异戊醇（V:V），振荡混匀。10000g离心10min。将上清液200µL转入

另一支1.5mL离心管，加入400µL-20℃预冷无水乙醇沉淀DNA。10000g离心1min，弃上清液，加入

500µL乙醇—乙酸铵溶液，6000g离心5min收集沉淀。加入100µLTE（pH8.0）溶液溶解DNA。用0.8%

的琼脂糖凝胶电泳检测DNA。使用紫外-可见成像系统观察DNA电泳条带的完整性。

6.3分子标记筛选

2

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用35对核心引物（见附录B，部分引用NY/T2474）进行PCR反应，扩增双亲