GB/T 35806-2018 动物流感检测 H7N9亚型流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法

ICS11.220

B41

国

=11:.

中华人民和国国家标准

J，、

GB/T35806-2018

动物流感检测H7N9亚型流感病毒

双重荧光RT-PCR检测方法

Animalinfluenzadetection-Protocolofduplexreal-timeRT-PCR

forinfluenzavirussubtypesH7andN9

2018-09-01实施

2018-02-06发布

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

发布

中国国家标准化管理委员会

GB/T35806-2018

目u昌

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由农业部提州。

本标准向全同动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归仁｜。

本标准起草单位：北京出入境检验检疫局检斡检疫技术中心、中同州入境检验检疫协会、中国农业

科学院哈尔滨兽医研究所、中同检验检疫科学研究院。

本标准主要起草人：蒲静、高志强、汪琳、乔彩霞、张锡金、周琦、张鹤晓、张伟、尹界、柏亚锋、刘艳华、

刘环、王秀荣、包红梅、韩雪清、王慧煌。

I

GB/T35806-2018

动物流感检测H7N9亚型流感病毒

双重荧光RT-PCR检测方法

1范围

本标准规定了同时检测H7和N9亚型动物流感病毒核酸的TaqMan双重荧光RT-PCR操作

方法。

本标准适用于H7和N9亚型动物流感病毒核酸的快速检测和筛查。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件

。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19438.1-2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法

GB19489实验室生物安全通用要求

3缩略i吾

下列缩[I各语适用于本文件。

Ct(s__xCp）值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阔值所经历的循环数（ThresholdCycle,or

CrossingPoint)

DEPC：焦碳酸二乙醋（Dicthypyrocarbonatc)

FAM：援基荧光素（Carboxyfluorescein)

HA:.1(11.凝素（Hemagglutinin)

HEX：六氯－6－甲基荧光素（Hexachlorofluoresccin)

MGB：小沟结合物（MinorGrooveBinder)

NA：神经氨酸陌（)Jeuraminidase)

TAMRA：援基四甲基罗丹明（Carboxytetramcthylrhodaminc)

荧光RT-PCR：实时荧光反转录聚合酣链反应（Real-timeRT-PCR)

4试剂和材料

4.1试剂

4.1.1总则：｜综另有说明，所用试剂均为分析纯，所用液体试剂均需使用无RNA陋的容器进行分装。

4.1.2TRizol:2°C～25℃保存。

4.1.3氯仿：2°C～8℃预玲。

4.1.4异丙醇：20℃预冷。

4.1.5DEPC水：配方见A.1。

GB/T35806-2018

4.1.675%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20℃预冷。

4.1.7PBS（含青霉素和链霉素）：配方见A,2o

4.1.8H7和N9亚型流感病毒双重荧光RT-PCR检测引物、探辛｜序列，反应液配方见附录Bo

4.1.9阳性、阴性对照

阳性对照：为灭活的H7N9亚型流感病毒液或体外转录的H7和N9cRNA。

阴性对照：为己知流感病毒阴性的动物组织悬液。

4.2仪器设备

4.2.1荧光PCR检测仪及配套反应管（版）。

4.2.2高速台式冷冻离心机（离心速度不低于12000r/min）。

4.2.3台式离心机。

4.2.4振荡器。

4.2.5组织匀浆器。

4.2.6冰箱（2℃～8℃和一20℃两种）。

4.2.7微量移液器（5µ.L、10µ.L、100µ.L、1000µ.L)及配套吸头。

4.2.81.5mL离心管（元核酸隅）和5mL采样管。

5实验室的标准化设置与生物安全管理

本方法的实验室设置与管理见GB/T19438.1-2004中的附录C；实验室生物安全管理见

GB19489。

6样品的采集与前处理

6.1总则

采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，注意无菌操作。

6.2采样工具

6.2.1采样专用商品化棉拭子、剪刀、慑子、研钵、5mL采样管、商品化一次性采样袋。

6.2.2｜馀商品化棉拭子、采样袋外，上述采样下具应经121。C土2°C,15min高压灭菌井烘干或经

160℃干炜2h。

6.3样品采集

6.3.1拭子样晶

根据动物种类，可采集咽喉拭子、泄殖腔拭子（禽）或鼻拭子（猪等其他动物）。采集方法如下：

一一取咽喉拭子时将拭子深入喉头及士顿裂来｜旦｜刮2次～3次井旋转，取分泌液；

一一取泄yl{腔拭子时将拭子深入？｜归自腔旋转一罔并沾取少量粪便；

一一取鼻拭子时将拭子深入鼻腔来回刮2次～3次并旋转，取分泌物。

将采样后的拭子放入盛有2.0mLPBS（含青霉素和链霉素）的采样管中，编号。

6.3.2组织