GB/T 31797-2015 啤酒花潜隐类病毒检疫鉴定方法

ICS65.020.01

B16

中华人民共和国国家标准

/—

GBT317972015

啤酒花潜隐类病毒检疫鉴定方法

DetectionandidentificationofHolatentviroid

p

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2015-07-03发布2015-11-27实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

发布

中国国家标准化管理委员会

/—

GBT317972015

前言

本标准按照/—给出的规则起草。

GBT1.12009

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Ⅰ

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GBT317972015

啤酒花潜隐类病毒检疫鉴定方法

1范围

本标准规定了啤酒花潜隐类病毒的检疫鉴定方法。

()、、

本标准适用于啤酒花Humulusluulus及其无性繁殖材料种子花粉上啤酒花潜隐类病毒的检

p

,()()

疫鉴定同时也适用于葎草Humulusaonicus和异株荨麻Urticadioica上啤酒花潜隐类病毒的检

jp

疫鉴定。

2规范性引用文件

。,

下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文

。,()。

件凡是不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于本文件

/分析实验室用水规格和试验方法

GBT6682

、

3仪器设备主要用具和主要试剂

3.1仪器设备

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()、()、、、、

电子天平感量0.001g普通天平感量0.1g高速冷冻离心机小型瞬时离心机普通冰箱超

()、、、、、、、、、

低温冰箱制冰机涡旋振荡器磁力搅拌器高压灭菌锅计仪微波炉电泳仪电

-80℃pHPCR

、、、、、、、、

泳槽凝胶分析成像系统实时荧光PCR仪杂交炉塑料薄膜封口机紫外交联仪暗箱摇床可调移

液器(,,,,,)。

2.5L10L20L200L1000L5000L

μμμμμμ

3.2主要用具

无RNase吸头(,,,,)、无RNase离心管(,,

10L20L200L1000L5000L1.5mL5mL

μμμμμ

)、、、、()、、、、

研钵研棒磁性分离架反应管实时荧光孔反应板杂交瓶杂交膜杂交

10mLPCR200L96

μ

、。

袋光片

X

3.3主要试剂

,,/。

除另有规定外所有试剂均为分析纯实验用水应符合GBT6682中相关规定RT-PCR检测试

;;。

剂见附录实时荧光检测试剂见附录斑点杂交检测试剂见附录

BRT-PCRCD

4检测样品制备

4.1种子类

,,,

随机抽取至少粒种子样品进行表面消毒后置于铺有吸水纸的白瓷盘或培养皿中在适宜的发

50

,();,至长

芽温度条件下催芽直至长出第一对真叶发芽时间大约一周或者在消毒的土壤中直接种植直

。,,。

出第一对真叶取适量叶片放入洁净的研钵中加入液氮后迅速研磨成细粉状

1

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GBT317972015

4.2种苗类

,

对于有症状的种苗类样品选取全部表现症状种苗类样品的叶片对于无症状的种苗类样品选取适

,,。

量样品的叶片放入洁净的研钵中加液氮后迅速研磨成细粉状

5检测与鉴定

5.1试验设计

。,

每个样品设置两个平行反应检测时以感染啤酒花潜隐类病毒的植物组织作为阳性对照以健康

,。

植物组织作为阴性对照以双蒸水代替模板作为空白对照

5.2普通RT-PCR方法

普通RT-PCR方法见附录B。

5.3实时荧光RT-PCR方法

实时荧光RT-PCR方法见附录C。

5.4斑点杂交方法

斑点杂交方法见附录D。

6结果判定国家标准ㅤ可打印ㅤ可复制ㅤ无水印ㅤ高清原版ㅤ去除空白页

,,

样品经普通RT-PCR检测为阳性且实时荧光RT-PCR检测为阳性或斑点杂交检测为阳性则判

定为检出啤酒花潜隐类病毒。

,,

样品经普通RT-PCR检测为阳性且序列测定结果与已知的HLVd序列一致则判定为检出啤酒

p

花潜隐类病毒。

7结果记录与样品保存

7.1结果记录与资料保存

:、、,、、,

完整的实验记录包括样品的来源种类时间试验的时间地点方法和结果等并要有实验人员

。,

和审核人员签字普通RT-PCR检测结果保存电泳照片实时荧光RT-PCR检测结果保存荧光曲线图

,,。

及值斑点杂交检测保存照片序列测定结果保存测序报告图

Ct

7.2样品保存与处理

,,

样品经登记人和经手人签字后妥善保存个月种子保存在干燥条件下或冰箱内生长苗木保

34℃

,。

存在隔离温室中其他繁殖材料可取实验样品在-80℃冰箱内保存对检出啤酒花潜隐类病毒的样品

,、。,。

应至少保存个月以备复检谈判和仲裁保存期满后应灭活处理

6

2

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GBT317972015

附录

A

()

资料性附录

啤酒花潜隐类病毒相关资料

A.1背景资料

A.1.1啤酒花潜隐类病毒基本信息

学名:。

Holatentviroid

p

缩写:。

HLVd

p

:()、()。

分类地位马铃薯纺锤形块茎类病毒科Posiviroidae椰子死亡类病毒属Cocadviroid

p

A.1.2方法原理

()、。

反转录聚合酶链式反应RT-PCR实时荧光RT-PCR反应及斑点杂交方法是本标准制定的主要依据

A.2寄主范围

,()、()

HLVd寄主范围较窄仅侵染啤酒花Humulusluulus葎草Humulusaonicus和异株荨麻

ppjp

()。

Urticadioica

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A.3病害症状

,,,

寄主受HLVd侵染后一般不表现症状但在英国啤酒花Omea品种受HLVd侵染后出现萎

pgp

、。

黄生长缓慢及球果较小等症状

A.4分布地区

:、、、、、、、、、、。

欧洲比利时捷克英国法国德国匈牙利波兰葡萄牙俄罗斯西班牙南斯拉夫

:、、()。

亚洲日本韩国中国新疆

:、。

美洲巴西美国

:。

非洲南非

:。

大洋洲澳大利亚

A.5传播方式

、;()、,

HLVd主要通过无性繁殖材料农事操作工具进行传播也可通过种子8%传毒率花粉传播

p

;。

但传毒率很低至今尚无昆虫介体传播的报道

A.6基因组

的基因组为一条环状单链,,,。

HLVdRNA长具有个功能区形成稳定的棒状二级结构

p256nt5

,。

HLVd通过不对称滚环模式进行复制基因组不编码蛋白质

p

3

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GBT317972015

附录

B

()

规范性附录

普通RT-PCR检测方法

B.1主要试剂

/磷酸氢二钾()

B.1.11molLKHPO

24

磷酸氢二钾17.42g

加双蒸水定容至100mL。用0.22m滤膜过滤除菌或高压蒸汽灭菌。

μ

/磷酸氢二钾()

B.1.22.5molLKHPO

24

磷酸氢二钾43.55g

加双蒸水定容至100mL。用0.22m滤膜过滤除菌或高压蒸汽灭菌。

μ

/乙酸钠()()

B.1.33molLNaAcH5.2

p

三水乙酸钠40.83g

用/乙酸调节至。用双蒸水定容至100mL。高压蒸汽灭菌。

3molLpH5.2

/氯化锂()国家标准ㅤ可打印ㅤ可复制ㅤ无水印ㅤ高清原版ㅤ去除空白页

B.1.44molLLiCl

氯化锂16.96g

。。。

加双蒸水定容至100mL用0.22m滤膜过滤除菌或高压蒸汽灭菌贮存于4℃

μ

B.1.5研磨缓冲液

异硫氰酸胍()/

GITC4molL

十二烷基肌氨酸钠/

5L

g

()()

曲拉通X-100TritonX-1000.1%体积分数

氯化钠()/

NaCl10mmolL

柠檬酸钠缓冲液()/

pH7.025mmolL

聚乙烯吡咯烷酮()/

PVP20L

g

B.1.650×TAE缓冲液

Tris碱242g

冰乙酸57.1mL

乙二胺四乙酸()(/,)

EDTA0.5molLH8.0100mL

p

加双蒸水定容到1L。

B.1.76×Loading缓冲液

溴酚兰/

2.5L

g

二甲苯青/

FF2.5L