DB37/T 3987-2020 兰花细菌性褐腐病菌检疫鉴定方法

ICS65.020.01

B16

DB37

山东省地方标准

DB37/T3987—2020

兰花细菌性褐腐病菌检疫鉴定方法

DetectionandidentificationofErwiniacypripedii

2020-06-08发布2020-07-08实施

山东省市场监督管理局发布

DB37/T3987—2020

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由青岛海关提出、归口并组织实施。

本标准起草单位：青岛海关技术中心、厦门海关技术中心、烟台海关技术中心。

本标准主要起草人：厉艳、廖富荣、静平、房保海、邵秀玲、封立平、李金庆。

I

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兰花细菌性褐腐病菌检疫鉴定方法

1范围

本标准规定了兰花细菌性褐腐病菌的分离培养、生理生化特征及分子生物学等检测鉴定方法。

本标准适用于兰花植株中兰花细菌性褐腐病菌的检测鉴定及该病害的田间调查与监测。

2兰花细菌性褐腐病菌基本信息

中文名：兰花细菌性褐腐病菌，杓兰欧文氏菌

学名：Erwiniacypripedii（hori）Bergeyetal.1923

异名：Pectobacteriumcypripedii（hori）Brenneretal.1973

Pantoeacypripedii

英文名：Bacterialsoftrotoforchid

分类地位：细菌域Bacteria，变形菌门Proteobacteria，γ-变形菌纲Gammaproteobacteria，肠杆

菌目Enterobacteriales，肠杆菌科Enterobacteriaceae，欧文氏菌属Erwinia。

传播途径：远距离传播主要靠带菌种苗，近距离传播主要借助叶面浇水、喷雾或施肥而将病原菌散

播至健康植株上，通过叶片伤口及自然孔口侵染，造成二次感染。

3原理

根据兰花细菌性褐腐病菌的特异性DNA序列进行分子生物学检测；根据兰花细菌性褐腐病菌的培养

性状、生物学特性、寄主范围及危害症状等对病原菌进行分离培养及致病性测定。

4仪器设备和主要试剂

4.1仪器设备及用具

PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、Biolog仪、显微镜、高速冷冻离心机、恒温培养箱、超净工作台、

高压灭菌器、水浴锅、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量可调加样器、剪刀、

解剖刀、玻璃棒、接种环、镊子、培养皿、酒精灯、三角烧瓶、量筒、离心管、滤纸等。

4.2主要试剂

除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和去离子水。PCR反应体系用双蒸水。商品化试剂参见

其使用说明。

NA培养基配制方法:蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，氯化钠5g，琼脂17g，调节pH至7.2，用蒸馏水

补充至1000mL，121℃高压灭菌15min。

5田间观察检测

1

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参照附录A中的症状描述观察植株是否有兰花细菌性褐腐病的典型症状，对出现典型症状或可疑症

状的植株进行拍照记录，并采集表现症状植株送实验室进行检测鉴定，田间无症状植株可随机采样。

6实验室检测

6.1样品制备

选择有褐腐症状的植株，用脱脂棉蘸取75%乙醇擦拭病部表面进行表面消毒，用灭菌剪刀剪取新鲜

病叶上的病健交界部位（无症状样品，随机选取叶片）组织置于培养皿内，用75%的乙醇（或1%的次

氯酸钠）表面消毒50s～60s，无菌水清洗3次，然后将其移至灭菌培养皿中，加适量无菌水，用灭菌

玻棒或剪刀捣碎组织，静置15min～20min后，即制成组织悬浮液，用于分离培养及分子生物学检测。

6.2分子生物检测

6.2.1模板制备

按照6.1的方法制备成样品悬浮液后，直接用商业化植物基因组DNA提取试剂盒按照操作说明提取样

品总DNA，-20℃保存备用。

对于分离