WS/T 571-2017 裂头绦虫幼虫检测

ICS11.020

C62

WS

中华人民共和国卫生行业标准

WS/T571—2017

裂头绦虫幼虫检测

Detectionofdiphyllobothroidlarvae

2017-08-01发布2018-02-01实施

中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布

WS/T571—2017

前言

本标准依据GB/T1.1－2009给出的规则起草。

本标准起草单位：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、上海出入境检验检疫局、上海市疾

病预防控制中心。

本标准起草人：陈韶红、李树清、张小萍、许学年、卢艳、蔡玉春、张永年、李浩、艾琳、郑彬。

I

WS/T571—2017

裂头绦虫幼虫检测

1范围

本标准规定了裂头绦虫幼虫检测的操作流程。

本标准适用于各级疾病预防控制机构、医疗机构和食品检测机构对鱼、蛙和蛇中裂头绦虫幼虫的检

测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T18088出入境动物检疫采样标准

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

裂头蚴plerocercoidlarvae

裂头绦虫的幼虫，是假叶目（Pseudophyllidea）、裂头科（Diphyllobothriidae）绦虫第三期幼

虫的总称（参见附录A）。

3.2

阔节裂头蚴plerocercoidlarvaeofDibothriocephaluslatus或phyllobothriumlatum

寄生在鱼体内阔节裂头绦虫的第三期幼虫。

3.3

曼氏裂头蚴plerocercoidlarvaeofSpirometramansoni

寄生在蛙、蛇或人体内曼氏迭宫绦虫的第三期幼虫。

4仪器器材

1

WS/T571—2017

4.1生物显微镜。

4.2体视显微镜。

4.3PCR扩增仪。

4.4电泳仪。

4.5凝胶成像系统。

4.6超净工作台。

4.7高速离心机。

4.8解剖用手术器械。

5试剂材料

5.1试剂

胃蛋白酶消化液；Tris-乙酸电泳缓冲液（TAE）；琼脂糖凝胶；6×加样缓冲液；100～2000bpDNA

marker；灭菌双蒸馏水(ddH2O)；70%乙醇（配制见附录B的B.1）。

5.2引物

扩增裂头蚴核糖体DNA转录间隔区（ITS）引物序列；扩增裂头蚴细胞色素C氧化酶（Cox1）引物序

列；阔节裂头蚴特异性引物序列及曼氏裂头蚴特异性引物序列（见附录B的B.2）。

5.3阳性对照

阳性对照为裂头绦虫相应基因片段的阳性克隆质粒或裂头蚴、裂头绦虫全基因组DNA。

6检测步骤

6.1样品准备

6.1.1样品种类：海鱼、淡水鱼、蛙和蛇。

6.1.2样品采集：采样按照GB/T18088执行。

6.2样品检测

6.2.1压片检查法

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WS/T571—2017

用手术剪对受检的鱼、蛙和蛇逐条/只进行解剖。取出内脏，将腹腔壁内膜刮下，观察腹腔内壁表

面，若有可疑白色点状物，用手术剪或手术刀分离皮肉，用两把小镊子将肌肉撕开，取含有白色点状物

的组织用载玻片压片，用生物显微镜镜检判定结果。

6.2.2蛋白酶消化法

称取样品250g并剪成小块，按样品与胃蛋白酶消化液1:5的比例加入消化液，37℃消化至无肉眼

可见的肉组织为止。消化后用0.8mm×0.8mm（10目）网筛过滤，滤液置于尖底量筒内，加水（用水参

照GB/T66828）至最大刻度处，沉淀洗涤至水清，全部沉渣置平皿，用体视显微镜镜检判定结果。

6.2.3核酸检测法

6.2.3.1取样

在体视显微镜下挑取虫体，初步鉴定后备用。PCR反应设立阳性对照，对照为裂头绦虫相应基因片

段的阳性克隆质粒或裂头蚴、裂头绦虫全基因组DNA。无菌水作空白对照。

6.2.3.2DNA的提取（见附录B的B.3）

6.2.3.3反应体系

总体积为25L,模板DNA2L，上下游引物（10mol/L）各0.5L，dNTPs2L，MgCl22.5L，

10×Buffer2.5L，Taq酶(5U/µL)0.2L，补充ddH2O至25L。

6.2.3.4PCR反应程序

94℃预变性3min；94℃变性3