NY/T 538-2002 鸡传染性鼻炎诊断技术

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B41

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中华人民共和国农业行业标准

NY/T538-2002

鸡传染性鼻炎诊断技术

Diagnostictechniquesforinfectiouscoryza

2002一08一27发布2002一12一01实施

中华人民共和国农业部发布

NY/T538-2002

前言

鸡传染性鼻炎(IC)是由副鸡嗜血杆菌((hpg)引起的一种鸡的急性上呼吸道传染病，本病在世界各

地均有发生，主要引起蛋鸡产蛋率下降、生长发育鸡群的生长受阻及淘汰率增加，造成很大的经济损失。

副鸡嗜血杆菌通常分为A,B,C三个血清型，在我国能引起传染性鼻炎的菌型目前为A型和C型，

它们具有共同抗原和各自的型特异性抗原，可以通过检测这些型特异性抗原来鉴定hpg的血清型。

本标准提供了多种诊断鸡传染性鼻炎的方法，在使用中应根据鸡群发病后至诊断时的间隔时间长

短及使用单位的具体情况选择使用。建议在鸡群发病早期采用病原的分离鉴定或聚合酶链反应((PCR)

方法进行诊断，感染一周以后可以采用血清平板凝集试验进行诊断，两周后可以采用琼脂扩散试验、间

接酶联免疫吸附试验(ELISA)和阻断ELSIA进行诊断，三周后以上各种检查抗体的方法均可使用。

本标准的附录A、附录B,附录C、附录D、附录E、附录F为规范性附录。

本标准由农业部畜牧兽医局提出。

本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。

本标准起草单位:北京市农林科学院畜牧兽医研究所。

本标准主要起草人:苗得园、陈小玲、张培君、陈葵、宋程、龚玉梅。

NY/T538-2002

鸡传染性鼻炎诊断技术

1范围

本标准规定了检测副鸡嗜血杆菌的细菌分离鉴定方法、PCR技术以及检测副鸡嗜血杆菌特异性抗

体的血清平板凝集试验、血凝抑制试验、间接酶联免疫吸附试验、阻断酶联免疫吸附试验的操作方法。

本标准适用于鸡和其他易感动物的传染性鼻炎的诊断。

2细菌的分离鉴定

2.1材料准备

2.1.1无菌棉拭子、鲜血琼脂平板培养基

2.1.2产烟酞胺腺嘿吟二核昔酸(或辅酶>NAD)表皮葡萄球菌。

2.2操作程序

2.2.1无菌打开可疑病鸡的眶下窦，用灭菌棉拭子蘸取其中粘液或浆液。

2.2.2用棉拭子在鲜血琼脂平皿上横向划线5-7条，然后取产NAD表皮葡萄球菌从横线中间划一

纵线。

2.2.3将划种好的平皿置于5%的二氧化碳(COQ)培养箱中37℃培养18h-24h.

2.2.4观察菌落特点。

2.2.5取分离物做过氧化氢酶试验，必要时通过进一步的生化反应做详细的特征鉴定。副鸡嗜血杆菌

的生化反应特点及过氧化氢酶试验方法见附录A,

2.2.6也可采用PCR鉴定可疑菌落，同时取病料或可疑菌落进行动物试验，方法见附录B,

2.3结果判定与表示方法

若鲜血琼脂培养基上出现“卫星样”生长的露滴状、针头大小的小菌落，即靠近产NAD表皮葡萄球

菌线处菌落较大，直径可达0.3mm，离产NAD表皮葡萄球菌线越远，菌落越小，过氧化氢酶阴性，结果

判为阳性，记为“+”，若无卫星现象，但有露滴状、针头大小的小菌落出现且过氧化氢酶阴性，则仍需采

用PCR或动物试验鉴定，以避免漏检不需NAD的副鸡嗜血杆菌。若无上述现象，则判为阴性，记为

3聚合酶链反应(PCR)技术

3.1材料准备

11.1PCR反应液、消化液、阴、阳性对照物，按说明书保存和使用。

3.1.2石蜡油、生理盐水、蒸馏水、1.5mL及0.5mL小离心管、吸头若干，均经灭菌处理。

3.1.3PCR仪、56℃水浴锅、微量加样器、小型高速离心机、冰块等。

3.1.4琼脂糖、电泳仪、水平电泳槽、紫外检测仪。

3.1.510mg/mL嗅化乙锭，加样缓冲液，TAE电泳缓冲液，配制方法见附录Ce

3.2操作程序

3.2.1PCR临床样品的采集

无菌打开可疑病鸡的眶下窦，用灭菌棉拭子蘸取其中粘液或浆液，浸人含。.8mL-1.0mL生理盐

水的1.5ml离心管内，室温放置。.5h后，将棉拭子在管壁上尽量挤干，然后弃至消毒液缸中。

NYr/'538-2002

3.2.2PCR临床样品的预处理

将浸过棉拭子的离心管以8000r/min-10000r/min离心10min，小心吸去大部分上清液，保留

20川左右液体(若原始样品中混有血液，可2000r/min离心3min-5min，使血球沉于管底，将上清

液转到新管里，再高速离心)。经上述处理过的样品，可开始消化，或在一20℃保存。

3.2.3PCR临床样品消化

用吸头将离心管中沉淀物与剩余液体混合均匀，从中取1kL置于含9pLPCR消化液的0.5mL

小离心管中(注意:做不同样品时应换吸头)，然后压紧离心管盖，56℃水浴1h，然后950C10min，再冰

浴10min后进行PCR扩增或置一20℃保存。

3.2.4PCR菌落样品制备

挑取平皿上的可疑菌落，加到含10pL蒸馏水的0.5mL的小离心管中，压紧管盖，95℃加热

10min，再冰浴10min后进行PCR扩增或一20℃保存。

3.2.5PCR阴阳性对照样品制备

用10夙消化液作为阴性对照样品，用9yL消化液加1kL已知阳性对照物作为阳性对照样品。

56`C水浴1h，然后95`C10min，再冰浴10min后进行PCR扩增或置一20℃保存。

3.2.6PCR扩增

将样品管瞬时离心，使附着于管顶、壁上的掖滴沉下，然后加人15CALPCR反应液，使总体积为

25VL。再瞬时离心，然后加人50pL矿物油硬盖，置PCR仪上进行扩增反应。程序为940C1min,650C

1min,72-C2min循环25次;94`C1min,650C1min,720C10min循环一次。

3.2.7琼脂精凝胶电泳

按照附录D制备。.7%的琼脂糖凝胶，从各PCR反应管中分别取10pL反应产物与2pL加样缓

冲液混合均匀，然后加人到样品孔中。初次操作时应设置DNA分子量对照，60V-80V稳压电泳

30min-50min，至加样缓冲液的染料带走出2cm-3cm时停止电泳。

3.2.8结果

在紫外检测仪下观察结果，必要时可拍照保存。

3.3结果判定与表示方法

阳性对照样品应呈现一条。.5kb的DNA带，阴性对照样品不应有这条带，被检样品若出现与阳性

对照同样大小的一条DNA带，则判为阳性，记作“+”，若无此带，则判为阴性，记为“一”。阴、阳性对照

应分别出现阴、阳性结果，否则，全部样品应该重做。

4血清平板凝集试验

4门材料准备

4.1.1鸡传染性鼻炎平板凝集试验抗原、阴、阳性对照血清，按说明书保存和使用，使用前与被检血清

一起恢复至室温。

4门.2试验用玻板(也可用载玻片)、可调微量加样器1个、灭菌吸头若干、记号笔。

4.2操作程序

4.2.1本试验在室温(20'C-25C)进行。

4.2.2先在玻板背面写好编号，每个样品间至少留20mm空隙，再在每个序号边加抗原15pL

4.2.3按玻板上的序号加对照或被检血清15爪，每个血清样品换一个吸头，将血清与抗原混匀，反应

持续3min-5min，在此时间内观察结果。每次试验均设阴、阳性对照。

4.2.4在黑色背景或在灯下明亮处观察并记录结果

4.3结果判定与表示方法

判定标准见表1,

NY/T538-2002

表1血清平板凝集试验判定标准

编号反应表现判定记录符号定性区分

I有明显架状或片状凝集片，液体清亮强阳性+++

z有大量针头样顺粒，量多，液休较清亮阳性+++

3针头样顺粒状，量较少，稍混浊弱阳性+

4液体无颗粒，均匀而混浊阴性

出现1,2,3号反应者为阳性，出现4号反应者为阴性。

5血凝抑制试验

5.1材料准备

5.1门鸡传染性鼻炎血凝抑制试验抗原、阴、阳性对照血清，按说明书保存和使用。